Quantitative Massenspektrometrie: Anwendungsbeispiele
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- Klaudia Michel
- vor 8 Jahren
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1 Quantitative Massenspektrometrie: Anwendungsbeispiele 1. Anwendung der Tandem-Massenspektometrie (MS/MS) für die Früherkennung der Phenylketonurie (PKU) im Rahmen des Neonatal- Screening Warum MS/MS zum Nachweis von PKU? Der herkömmliche Test ist wenig empfindlich Er liefert einen hohen Anteil falsch-positiver Werte (1 von 9) MS/MS bestimmt das Verhältnis Phe - Tyr und anderer Aminosäuren sehr viel empfindlicher und genauer MS/MS liefert keine falsch-positiven Werte (basierend auf den Proben von mehr als Neugeborenen)
2 Störung im Phenylalanin-Stoffwechsel bei Phenylketonurie N Phenylalanin H Hydroxylierung X Phenylalanin- Monooxygenase H Tyrosin N H vermehrte Ausscheidung im Harn
3 Probenvorbereitung für das MS/MS-Experiment 1. Bluttropfen auf Filterpapier 2. Extraktion mit Methanol und gelösten isotopenmarkierten Standards 3. Gefriertrocknung 4. Derivatisierung der Aminosäuren zu Butylestern R N Derivatisierung R N H Aminosäure 4 H 9 Aminosäurebutylester 5. Gefriertrocknung 6. Lösen im Fließmittelsystem und Injektion
4 MS/MS-Experiment: Neutralteilverlust-Analyse H 3 N R 4 H 9 ID N H R H 4 H 9 Ameisensäurebutylester 102 u
5 Neonatal-Screening zum Nachweis von Phenylketonurie (PKU). MS/MS-Spektren (neutral loss scan) einer Kontrollprobe (ontrol) und einer PKU-positiven Probe (Positive). Phe = [M+H] + Phenylalanin, Tyr = [M+H] + Tyrosin, I.S. = stabilisotopmarkierte interne Standards der Aminosäuren Phe und Tyr.
6 Quantitative Massenspektrometrie: Anwendungsbeispiele 2. Quantitative Analyse von Membranlipiden durch nano-elektrospray- Tandem-Massenspektrometrie Quelle: B. Brügger, G. Erben, R. Sandhoff, F.T. Wieland, and W.D. Lehmann, Quantitative analysis of biological membrane lipids at the low picomole level by nano-electrospray ionization tandem mass spectrometry, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, (1997)
7 a) Elektrospray-Massenspektren eines unbehandelten Phospholipid-Extrakts. a) Spektrum der negativen Ionen ESI R R H P H phosphatidyl inositol PI H H H R R H P 2 phosphatidyl ethanolamine PE NH 3 R R H P 2 phosphatidyl serine PS H H R R H P 2 phosphatidyl glycerol PG Na H NH 3 H H
8 b) Elektrospray-Massenspektren eines unbehandelten Phospholipid-Extrakts. b) Spektrum der positiven Ionen ESI R R H P 2 phosphatidyl choline P N(H 3 ) 3 R R H P 2 phosphatidyl ethanolamine PE NH 3 H 3 ( ) 12 H R H N H H H H P 2 sphingomyeline SM N(H 3 ) 3 R R H P 2 phosphatidyl serine PS H H NH 3
9 a) b) Produktionen der negativen Molekülionen zweier Phospholipide. a) Produktionenspektrum des Ions [M-H] - des PI-(36:2). b) Produktionenspektrum des Ions [M-H] - des PS-(36:1).
10 Zusammenfassung der klassenspezifischen MS/MS-Experimente zur harakterisierung von Phospholipiden. specificity polarity fragment structure scan mode fragment type pictogram all [M-H]- ions of neg. glycerophospholipids phosphatidylinositol neg. phosphatidylserine neg. - H P - P = - H H H H H precursor of 153 glycerolphosphate - precursor of 241 head group - -ESI 241 N neutral loss of 87 head group - H 3 P ESI -ESI Phosphatidylethanolamine neg. -P-- - -N - precursor of 196 dilyso - -ESI H H 3 sphingomyelin neg. sid + head group -ESI =P-- - -N 168 precursor of (demethylated) H phosphatidylcholine and sphingomyelin pos. H H 3 =P N - H 3 precursor of 184 head group +ESI 184 H H 35 3 Phosphatidylethanolamine pos. H - P-- - -NH 3 - neutral loss of 141 head group 185 phosphatidylserine pos. H - P--H neutral loss of 185 head group 2 -H-H +ESI - NH ESI
11 Spezifischer Nachweis von Phospholipid- Klassen in einem unbehandelten Lipidextrakt durch negativ-esi-ms/ms. a) Nachweis von PI durch Vorläuferionenanalyse des Ions 241. b) Nachweis von PS durch Neutralteilverlustanalyse der Masse 87 amu. c) Nachweis von PE durch Vorläuferionenanalyse des Ions 196. d) Nachweis von SM durch Kombination von Skimmer-ID und Vorläuferionenanalyse des Ions 168. a) [M-H]- of PI b) ESI [M-H]- of PS c) ESI [M-H]- of PE - ESI d) ESI [M-16]- of SM
12 Spezifischer Nachweis von Phospholipid-Klassen in einem unbehandelten Lipidextrakt durch positiv-esi-ms/ms. a) Nachweis von P und SM durch Vorläuferionenanalyse des Ions 184. b) Nachweis von PE durch Neutralteilverlustanalyse der Masse 141 amu. c) Nachweis von PS durch Neutralteilverlustanalyse der Masse 185 amu. a) b) [M+H] + ions of SM + P [M+H] + ions of PE ESI ESI c) [M+H] + ions of PS ESI
13 Quantitative Bestimmung von Phospholipiden. Unbehandelter Lipidextrakt mit äquimolaren Anteilen der P-(24:0), -(28:0), - (40:0) und -(44:0) als interne Standards. Vorläuferionenanalyse des Ions 184. a) Unkorrigierte Intensitäten der internen Standards. b) Rechnerisch korrigierte Intensitäten. Die Molekülionensignale geben die wahren molaren Verhältnisse wieder. a) (original data) + ESI 184 int. standard P-(24:0) b) int. standard P-(28:0) mass dependent correction factor F for P signals derived from calibration curve F = 1/( x x 2 ) int. standard int. standard P-(24:0) P-(28:0) 'normalized' calibration curve 100 P-(32:1) P-(34:1) P-(34:1) P-(36:2) P-(36:2) calibration curve y = x x 2 P-(38:2) (corrected) P-(38:2) int. standard P-(40:0) int. standard P-(40:0) int. standard P-(44:0) int. standard P-(44:0) P-(32:1)
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