HYDRAGEL CSF ISOFOCUSING. Tipps und Tricks in der Durchführung der isoelektrischen Fokussierung

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Leonard Armbruster
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1 HYDRAGEL CSF ISOFOCUSING Tipps und Tricks in der Durchführung der isoelektrischen Fokussierung

2 Einführung CSF (Cerebro Spinal Flüssigkeit) 80% der Bestandteile stammen aus dem Serum 20% stammen von Nervenzellen oder Zellen die das ZNS infiltriert haben Überprüfung der CSF Reflektiert teilweise Gewebeschädigungen und /oder entzündliche Prozesse Hilft bei der Diagnose einiger neurologischer Erkrankungen Entzündliche Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere Multiple Sklerose Lymphozyteninfiltration Intrathekale Synthese von IgG häufig assoziiert mit einer eingeschränkten Heterogenität oligoklonale Banden in der Gammazone der Elektrophorese

einiger neurologischer Erkrankungen Entzündliche Erkrankungen des Nervensystems, insbesondere Multiple Sklerose Lymphozyteninfiltration

3 Prinzip der isoelektrischen Fokussierung (IEF) Proteine werden entsprechend ihres isoelektrischen Punktes (Pi) getrennt: Durch Ampholyte wird in einem Gel ein linearer ph Gradient erzeugt Am isoelektrischen Punkt (Pi) beträgt die Nettoladung des Moleküls gleich 0 sie stoppen im Gel Lowest ph Highest ph Prinzip der IEF

ein linearer ph Gradient erzeugt Am isoelektrischen Punkt (Pi) beträgt die

4 Einführung Entsprechend dem Europäischen Konsensus für Multiple Sklerosis (MS): Ist die intrathekale Synthesis ein Indikator für die Diagnose von MS Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wird für den Nachweis der lokalen IgG Synthese empfohlen

Indikator für die Diagnose von MS Die isoelektrische

5 Prinzip des SEBIA Assays Folgt den Empfehlungen des Europäischen Konsensus Patienten Serum und CSF werden parallel analysiert, um Unterschiede in der IgG Verteilung sichtbar zu machen Der Test wird in 2 Schritten durchgeführt: IEF im Agarosegel um die Proteine aufzutrennen Immunfixation mit Peroxydase-gelabeltem Anti-IgG zur Detektion von oligoklonalen IgG Banden Quantifizierung der Immunglobuline mittels turbidimetrischer oder nephelometrischer Techniken / CSF und Serum müssen auf die gleiche IgG Konzentration eingestellt werden

aufzutrennen Immunfixation mit Peroxydase-gelabeltem Anti-IgG zur Detektion von oligoklonalen IgG Banden Quantifizierung der

6 Proben für die Analyse Um eine korrekte, vergleichbare Interpretation zu gewährleisten ist es unerlässlich CSF und Serum zur gleichen Zeit zu entnehmen; Alles was die Immunglobuline des Patienten verändern könnte, ist zu vermeiden Die IgG Konzentration in den zugehörigen CSF- und Serumproben auf den gleichen Level einzustellen Die Ig Konzentration im CSF sollte mit einer geeigneten Methode bestimmt werden.

verändern könnte, ist zu vermeiden Die IgG Konzentration in den zugehörigen CSF- und Serumproben auf

7 Ergebnisse und Interpretation Intrathekale Synthese von IgG im ZNS Vorhandensein von IgG Banden in der CSF-Spur, die in der Serum-Spur fehlen Praktisch zwei oder mehr Banden bestätigen eine lokale IgG Synthese Die Anzahl der Banden korreliert nicht mit der Schwere der Krankheit oder der Prognose 5 Befundtypen werden unterschieden (Schema)

Banden bestätigen eine lokale IgG Synthese Die Anzahl der Banden korreliert nicht

8 Ergebnisse und Interpretation Schema der 5 Bandenmuster

9 Gel Beispiele

10 Vorbereitung der Migration Gel Pufferstreifen

11 Probenbeladung Mikroporöse Einwegapplikatoren Feuchte Kammer 2 Spuren pro Patient

12 Auflegen einer Kunststofffolie die die Ampholyte vor CO 2 abschirmt und so den ph- Gradienten stabilisiert. Vorbereitung der Migration Einsetzen des Applikators

13 Antiserenauftrag mit der Dynamischen Maske

14 Antiserenauftrag mit der Dynamischen Maske

15 Abblotten der nicht präzipitierten Proteine Abblotten des Antiserenüberschusses und Entfernung der nicht immunpräzipitierten Proteine aus dem Gel mit einem dicken Filterpapier

16 Waschen und Rehydrieren des Gels und erneutes Abblotten Waschen und Rehydrieren des Gels im Gerät unter Kunststoffmaske und anschließendes Abblotten

17 Färben des Gels und erneutes Abblotten Färben des Gels im Gerät unter Kunststoffmaske und anschließendes Abblotten

19 Trocknen des Gels Das getrocknete Gel kann direkt ausgewertet werden.

20 Waschen des Gels Zur Aufbewahrung sollte das Gel einmal mit dem Programm «Waschen Isoenzyme» gewaschen werden. Gelhalter

21 HYDRAGEL 9 CSF ISOFOCUSING

22 Beispiele für Typ 1 Liquor / Serum Liquor / Serum Liquor / Serum Liquor / Serum

23 Beispiele für Typ 2 Liquor // Serum Liquor / Serum Liquor / Serum

24 Liquor Serum // Serum Liquor Beispiele für Typ 3 Liquor // Serum Liquor / Serum

25 Beispiele für Typ 4 Liquor / Serum Liquor / Serum

26 Beispiele für Typ 5 Liquor / Serum Liquor / Serum

27 Gel Beispiele

28 Gel Beispiele

29 Gel Beispiele

30 Ergebnisse und Interpretation Pathologien bei denen Oligoklonale Banden gefunden werden können

31 Fazit HYDRAGEL CSF ISOFOCUSING erfüllt alle Empfehlungen des Europäischen Konsensus für Multiple Sklerose: Isoelektrische Fokussierung zur Trennung von IgG Nachweis der Oligoklonalen IgG Banden durch ein spezifisches Antiserum Immunreaktion um nachzuweisen, dass die vorhandenen Banden Immunglobiline sind Serum und CSF sollten parallel und mit der gleichen IgG Konzentration analysiert werden Unkonzentrierte CSF

32 Artikelnummern HYDRAGEL 3 CSF ISOFOCUSING MD Cat. Nb HYDRAGEL 9 CSF ISOFOCUSING MD Cat. Nb Anti IgG-Per Antiserum Cat. Nb. 4743

33 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit sebia GmbH Münsterfeldallee 6 D Fulda ( 0049(0) FAX 0049(0) : sebia@sebia.de

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