ICPL Eine High-Throughput-Methode für die quantitative Proteomanalytik

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1 ICPL Eine High-Throughput-Methode für die quantitative Proteomanalytik Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Alexander Schmidt aus Erlangen

2 2 Summary Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Universität Erlangen-Nürnberg Tag der mündlichen Prüfung:. Februar 26 Vorsitzender der Prüfungskommission: Erstberichterstatter: Zweitberichterstatter: Drittberichterstatter: Prof. Dr. DP. Häder Prof. Dr. M. Pischetsrieder Prof. Dr. D. Oesterhelt PD. Dr. C. Eckerskorn

3 Inhaltsverzeichnis Summary... I Abkürzungen Einleitung Proteomics: Ein Überblick Verfahren der differenziellen Proteomanalyse Zweidimensionale-Gelelektrophorese / Massenspektrometrie (2DE-MS)-Ansatz Isotopenmarkierung / Multidimensionale Flüssigkeitschromatographie / Tandem Massenspektrometrie (ICAT)-Methode Vor- und Nachteile der beiden Analyseverfahren Durchführung einer differentiellen Proteomanalyse und Methodische Grundlagen Festlegung der Fragestellung und exakte Definition der Ausgangsbedingungen für die Proteomanalyse Probenvorbereitung Trennung der Proteinproben Zweidimensionale Gelelektrophorese Mehrdimensionale Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie Quantifizierung der Proteine Massenspektrometrie Prinzip In der Proteomanalytik verwendete Ionenquellen Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) Massenanalysatoren Verwendete Massenspektrometer ESI-Triple-Quadrupol-Massenspektrometer MALDI-TOF/TOF-Massenspektrometer Proteinidentifizierung Peptide-Mass-Fingerprint (PMF)-Methode Peptid-Sequenzierung mittels Massenspektrometrie (MS/MS-Methode) Datenbanksuche Bioinformatik Datenauswertung Datenverwaltung Dateninterpretation Isotopenmarkierung: Ein neuer Ansatz zur automatisierten differenziellen Proteomanalyse Chemische Isotopenmarkierung von Proteinen Chemische Isotopenmarkierung von Peptiden Metabolische Isotopenmarkierung Enzymatische Isotopenmarkierung Modifikation mit isotopenfreien Reagenzien Zusammenfassung Aufgabenstellung Experimenteller Teil Verwendete Materialien Chemikalien und Materialien Technische Geräte Software Synthese isotopenmarkierter Succinimidester d-/d3-essigsäuresuccinimid (nach Ji et al., 2) d-/d5-/ 13 C 3 -Propionsäuresuccinimid d-/d3-/d7-buttersäuresuccinimid d-/d4-/ 13 C 6 -Nicotinsäuresuccinimid (nach Hausch et al., 21) Guanidino-Benzoesäure- und 4-Imidazolessigsäuresuccinimid... 38

4 ii Inhaltsverzeichnis 3.3 Isotopenmarkierung von Proteinen (allgemeine Vorgehensweise) Probenvorbereitung Carbamidomethylierung Isotopenmarkierung Probenentsalzung Aceton-Fällung Dialyse Ultrafiltration LC-ESI-MS Analyse (allgemeine Vorgehensweise) Messung kompletter Proteine Analyse von Peptiden Überprüfung der hergestellten Reagenzien Zweidimensionale Gelelektrophorese (allgemeine Vorgehensweise) Isoelektrische Fokussierung (1. Dimension) SDS-PAGE (2. Dimension) Silberfärbung der Proteine Enzymatische Spaltung der Proteine im Gel Entfärben der Gelstücke Enzymatische Spaltung Elution der Peptide MADLI-TOF/TOF Messung (allgemeine Vorgehensweise) MALDI-TOF/TOF Analyse Probenvorbereitung Präparation der Proben Verwendete Parameter Nano-LC-MALDI-TOF/TOF Messung von Peptiden Probenvorbereitung HPLC Setup Automatisches bespotten der MALDI-Targets Proteinquantifizierung (MS-Analyse) Proteinidentifizierung (MS/MS-Analyse) Datenbanksuche Validierung und Visualisierung der Daten Isotopenmarkierung eines Proteingemisches Multiplex Analyse am Beispiel von Myoglobin Präparation ICPL markierter E.coli-Proteine µlc-maldi-ms/ms-analyse eines Proteingemisches Analyse von Membranproteinen Kultivierung von Halobacterium salinarum Isolation der Membranproteine Isotopenmarkierung Eindimensionale SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (1DE) LC-MS/MS Analyse Datenauswertung Differenzielle Analyse von normalem und karzinogenem humanen Nierengewebe Probengewinnung mittels Laser-Capture Microdissection ICPL Modifizierung Eindimensionale Gelelektrophorese LC-MS/MS Messung Datenanalyse Ergebnisse Prinzip von ICPL Isotopenmarkierung freier Aminogruppen in Proteinen Vergleich verschiedener Reagenzien Optimierung der Reaktionsbedingungen ph-wert Puffer Temperatur Reagenzmenge Proteinkonzentration der Probe...63

5 Inhaltsverzeichnis iii Nebenreaktionen Abschließende Verbesserungen Quantitative Analyse von ß-Lactoglobulin Erhöhte MS-Empfindlichkeit mit basischen Reagenzien Genaue Bestimmung der Modifizierungseffizienz DE Analyse von isotopenmarkiertem Myoglobin MALDI-MS Messung der isotopenmarkierten Peptide Reaktionskinetik Charakterisierung der Nebenreaktionen Quantitative Analyse: Genauigkeit und Reproduzierbarkeit Quantitative Analyse eines Proteingemisches Reproduzierbarkeit der Quantifizierung Dynamischer Bereich Quantifizierung sehr geringer Probenkonzentrationen Fragmentierungsverhalten modifizierter Peptide Quantitative Bestimmung von Phosphorylierungsstellen Multiplex Analyse Trennung isotopenmarkierter Proteine mittels 2DE Quantitative Analyse von sechs Standardproteinen DE-Trennverhalten von d-/d4-nicotinoylierten Proteinen Analyse eines mit Standardproteinen versetzten E.coli-Lysats Wiederfinden der zugesetzten Proteine Quantifizierung von E.coli-Proteinen Identifizierung basischer Proteine RP-LC-MS/MS Analyse von modifizierten Peptiden Analyse des Elutionsverhaltens mittels LC-ESI-MS Einfluss der Nicotinoylierung Isotopeneffekt verschiedener Reagenzien Quantitative Analyse eines Proteingemisches mittels LC-MALDI-TOF/TOF Quantitative Bestimmung von Membranproteinen des Energiestoffwechsels von H. salinarum Biologische Fragestellung Präparation der Probe LC-MS/MS Analyse Suche nach Bakteriorhodopsin Anteil an Membranproteinen Regulierte Proteine Posttranslationale Modifikationen Reproduzierbarkeit Identifizierung neuer Tumormarker für das Nierenzellkarzinom Laser-Capture Microdissection Isotopenmarkierung und 1D-SDS PAGE LC-MS/MS Analyse Einzelne regulierte Proteine Posttranslationale Modifikationen Proteinabbau Identifizierte Membranproteine Diskussion Optimierung der Modifizierungsreaktion Verschiedene Isotopenreagenzien D-Gelelektrophorese Einfluss der Isotopenmarkierung auf das Trennverhalten Quantifizierung der Proteine Vergleich mit der zweidimensionalen differenziellen Gelelektrophorese (DIGE) Weitere Vorteile der ICPL-Methode Vergleich mit anderen Isotopenmarkierungsmethoden Chemische Isotopenmarkierung von Proteinen Chemische Isotopenmarkierung von Peptiden Metabolische Isotopenmarkierung

6 iv Inhaltsverzeichnis 5.5 Herausforderungen für Großansätze Analyse von Membranproteinen von H. salinarum Löslichkeit hydrophober Proteine Identifizierte Proteine Anteil falsch positiv identifizierter Peptide Regulierte Proteine ICPL-Analyse des Nierenzellkarzinoms Das Nierenzellkarzinom Analyse kleiner Probenmengen Regulierte Proteine Glykolyse Atmungskette Protein Biosynthese Annexine Heat-Shock-Proteine Sonstige Proteine Detektion, Validierung und Entwicklung von Biomarkern Schlussfolgerung Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Danksagung Eigene Publikationen zum Thema der Dissertation Lebenslauf Appendix Identifizierte Membranproteine aus H. salinarum Identifzierte Proteine einer Nierentumorgewebsanalyse

7 Summary Determination of changes in protein expression and their modifications is one key focus in proteome research. Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) followed by mass spectrometry (MS) based techniques like peptide mapping or MS-sequencing (MS/MS) is still the most popular approach to relatively quantify and identify proteins within complex mixtures. Despite its high resolving power, 2DE suffers from some limitations that confine high-throughput proteome analysis. This can be primarily ascribed to the difficult automation of the workflow and the low reproducibility and accuracy for protein quantification. With the ICAT approach, a very elegant strategy was developed which has shown to overcome most of the drawbacks of 2DE and thus represents a powerful alternative for comparative proteome analysis. Since then, many groups have adopted the principle of this strategy, generating different approaches for quantitative proteome analysis. However, most methods presented to date still have severe limitations that confine the quantitative analysis of posttranslational modifications (PTMs) and the separation of highly complex protein mixtures like whole cell lysates. Therefore a novel approach was developed that is able to characterise PTMs and protein degradation and allows the separation of complex proteomes. This was achieved by isotopic labelling of the frequent free amino groups in proteins. This enables the reduction of complexity on both, the protein and the peptide level followed by automated high-throughput identification and quantification of proteins using mass spectrometry. Since isotope labels are introduced to the frequent amino groups, most peptides of a protein can be utilized for ratio calculation, resulting in high sequence coverage (usually 4 to 6 %) which is indispensable for the characterisation of PTMs and degradation products. The work was divided into three major parts. In the first part, a protocol for complete modification of all free amino groups in model proteins was established using different isotope labelling reagents. After optimization of the reaction conditions a quantitative (> 99.8 %) and selective (no detectable side products) derivatization of all amino groups could be achieved. This allowed highly accurate (error < %) and reproducible (deviation <4 %) quantitation of proteins. Furthermore, the analysis of a spiked E.colilysate demonstrated that the excellent accuracy and reproducibility of the ICPL-Method was maintained even when analysing complex protein mixtures. Additionally, several amino-reactive reagents have been evaluated concerning solubility, separation quality, MS-sensitivity and MS/MS fragmentation behaviour. For increased throughput, a

8 II Summary multiplexed strategy was developed to simultaneously compare 3 samples in one single experiment. In the second part, it could be demonstrated that the ICPL-approach in combination with LC-MALDI-TOF/TOF also allowed the identification and accurate quantification of hydrophobic membrane proteins of H. salinarum containing up to 16 transmembrane domains. The average deviation between the calculated ratios of two independent LC- MS/MS analyses was only 7 %, confirming the high reproducibility of the developed method. Furthermore, the number of lysine residues of labelled peptides that can be easily calculated from the mass gap of an isotope peptide pair serves as a strong constraint in database searches. Therefore, the number of significant peptide identifications could be increased by 3 %. In the third part of this work, the high MS-sensitivity of the ICPL-approach and the potential for biomarker discovery was demonstrated by the analysis of renal cell carcinoma cells (RCC). Therefore, two protein samples, both consisting of only cells, were prepared from normal and RCC tissue by Laser-Capture Microdissection. After labelling both protein mixtures with the light and the heavy version of the ICPLreagent, respectively, the two mixtures were combined and separated using 1D-SDS- PAGE. The proteins were excised, digested with trypsin and analysed by offline LC- MALDI-TOF/TOF. Using this strategy, more than 5 different protein species, multiple post-translational modifications and numerous highly regulated proteins could be identified and quantified. Furthermore, the ICPL-method showed high potential for the analysis of protein degradation and enabled the detection of some differentially degraded protein species. Many of the identified proteins that change in abundance are also described in the literature and could be confirmed (e.g. Warburg-Effect). Additionally, several regulated proteins could be determined that have not yet been associated with kidney cancer. Further analyses need to be carried out to evaluate and validate potential biomarkers for RCC found in this study.

9 Abkürzungen 1DE Ein-dimensionale Gelelektrophorese 2DE Zwei-dimensionale Gelelektrophorese 2D-Gel Zwei-dimensionales Gel Ac Acetyl- Ac-NHS Essigsäuresuccinimid ACN Acetonitril ATM Accurate-Mass-Tag But Butyl- But-NHS Buttersäuresuccinimd BSA Rinderserumalbumin CHAPS 3-[(3-Clolamidopropyl)-dimethylammonio]-propansulfonat CHCA α-cyano-4-hydroxyzimtsäure CID collision induced dissociation Da Dalton DCC N,N -Dicyclocarbodiimid DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure DIGE difference gelelectrophoresis DMF Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DTT Dithiothreitol dx- Anzahl der enthaltenden Deuteriumatome ESI Elektrospray-Ionisation FFE Free Flow Elektrophorese GB 4-Guanidino-benzoesäure GB-NHS 4-Guanidino-benzoesäuresuccinimid GIST Global-Internal-Standard Technology HEPES Hydroxyethyl-piperazylsulfonsäure HPLC Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie HSP Heat Shock Protein ICAT Isotope-Coded Affinity Tags ICPL Isotope-Coded Protein Label IEF Isoelektrische Fokussierung IPG Immobilisierter ph Gradient itraq isobaric tags for relative and absolute quantitation kda Kilo Dalton

10 2 Abkürzungen m/z Masse-zu-Ladung MALDI Matrix-unterstützte Laserdesorption/Ionisation MS Massenspektrometrie MS/MS Tandem Massenspektrometrie MW Molekulargewicht NHS N-Hydroxysuccinimid Nic Nicotinsäure Nic-NHS Nicotinsäuresuccinimid LC Flüssigkeits-Chromatographie LCM Laser-Capture Microdissection PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese Prop Propyl- Prop-NHS Propionsäuresuccinimid PTM Posttranslationale Modifikation SDS Natriumdodecylsulfat SILAC stable isotope labeling by amino acids in cell culture TCEP Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid TOF Time-of-flight THF Tetrahydrofuran TFA Triflouressigsäure Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

11 1 Einleitung 1.1 Proteomics: Ein Überblick In den letzten Jahren wurden zahlreiche Genomprojekte erfolgreich abgeschlossen, die die Sequenzierung gesamter Genome verschiedener Organismen zum Ziel hatten. Ihren Höhepunkt feierte die Genomanalyse sicherlich mit der Entschlüsselung des menschlichen Genoms vor vier Jahren, das mit 2.85 Milliarden Basenpaaren das größte existierende Genom darstellt [Lander et al., 21, Venter et al., 21, Abdellah et al., 24]. Aber trotz der großen Erfolge und Fortschritte auf dem Gebiet der genomischen Arbeitsmethoden blieben viele Fragen ungeklärt. Denn das relativ statische Genom läst kaum Rückschlüsse auf die stark dynamischen Abläufe zu, die in jedem Organismus stattfinden. Somit können viele biologische Prozesse und Funktionen eines Organismus allein mit den Genomdaten nicht erklärt werden. Mit dem in Bild 1.1 (aus Lottspeich, 1999) gezeigten Beispiel kann dies eindrucksvoll demonstriert werden. Obwohl jede somatische Zelle des abgebildeten Schmetterlings und seiner Raupe die identische genetische Information besitzt, liegen hier zwei völlig unterschiedliche Phänotypen des Insekts vor. Grund dafür ist die unterschiedliche Umsetzung der genetischen Information, d.h. die Expression der einzelnen Gene in Proteine. Letztere steuern als Werkzeuge und ein Werkstoffe einer Zelle die Genom biologischen Abläufe und Funktionen in einem Organismus. Zusätzlich werden fast alle Proteine während und nach ihrer - verschiedene Expression noch weiter modifiziert und können meist dadurch erst ihre Proteome eigentliche Funktion ausüben. (Orgyia antiqua L.) Beispielsweise wird über die Bindung Bild 1.1 Raupe und Falter von Orgyia antiqua L. kleiner Moleküle an bestimmte Aminosäuren die Lokalisation und Aktivität [Proud et al., 25] von vielen Proteinen gesteuert. Diese so genannten posttranslationalen Modifikationen spielen außerdem zentrale Rollen bei der Übertragung von Signalen [Mann et al., 22, Tischer und Bastiens, 23] und bei Interaktionen zwischen verschiednen Proteinen [Restle et al., 25]. Eine Analyse der exprimierten und modifizierten Proteine ist daher für die Charakterisierung von Proteinfunktionen und das Verständnis biologischer Vorgänge essentiell. Dies kann nur durch proteinanalytische Arbeitsmethoden erreicht werden, die

12 4 1 Einleitung in den letzten sechs Jahren zunehmend in den Fokus der Wissenschaft geraten sind. Mit Hilfe moderner hochsensitiver Trenn- und Analysetechniken versucht man, alle Proteine einer Zelle oder Organismus (Proteom) zu untersuchen. Ein Proteom ist (nach Lottspeich) definiert als das zu einem bestimmten Zeitpunkt und unter exakt definierten Randbedingungen quantitativ ermittelte Proteinmuster eines Organismus, einer Zelle, einer Organelle oder auch einer Körperflüssigkeit [Lottspeich, 1999]. Da das Proteom im Gegensatz zum Genom sehr dynamisch ist und durch viele äußere Faktoren (z.b. Temperatur, Stress, ) beeinflusst wird, ist es sehr wichtig, definierte Ausgangsbedingungen bei der Probengewinnung für eine erfolgreiche Proteomanalyse zu erstellen. Im Allgemeinen werden für eine Proteomanalyse so genannte subtraktive oder differenzielle Ansätze ausgeführt, bei denen zwei oder mehrere genau definierte Zustände (z.b. normaler und pathogener Zustand oder Zellen vor und nach Zugabe eines Wirkstoffs) verglichen werden können [Lottspeich, 1999]. Aus den gefundenen quantitativen Veränderungen einzelner Proteine können dann Informationen über involvierte funktionelle Netzwerke (Pathways, Signalkaskaden, etc.) erhalten werden und über eine Korrelation mit dem Phänotyp eine funktionelle Aussage erreicht werden. Aber nur in Kombination mit molekularbiologischen Methoden der Genomanalyse kann die Proteomanalyse neue und tiefere Einblicke in die komplexen biologischen Vorgänge der Natur eröffnen. In diesem Zusammenhang wurde erst vor kurzem wurde der Begriff Systembiologie eingeführt. Hier soll versucht werden, systematisch sämtliche physiologische Prozesse in Zellen oder Geweben zu untersuchen und zu charakterisieren. Letztendlich ist das Ziel der Systembiologie, aus den gewonnen Daten Modelle zu generieren, die die Physiologie einer Zelle darstellen und simulieren können. Proteomics kann dazu einen entscheidenden Beitrag leisten, denn die Untersuchung der Proteine als eigentliche Funktionseinheiten der Zelle ergibt überaus wertvolle Daten für die Beschreibung und das Verständnis biologischer Vorgänge. 1.2 Verfahren der differenziellen Proteomanalyse Eine große Herausforderung in der Proteomanalytik stellt immer noch die hohe Komplexität gesamter Proteome dar. Der daraus resultierende hohe analytische Aufwand erschwert eine schnelle und kostengünstige Messung der zahlreichen Proteinproben, wie sie bei einem typischen Proteomexperiment anfallen. Daneben sind sehr hohe Konzentrationsunterschiede zwischen einzelnen Proteinspezies (bis bei Plasma) [Anderson et al., 22] und die große Heterogenität der Proteine (Hydrophobizität, Größe, etc.) weitere analytische Herausforderungen, die es zu bewältigen gilt. Zudem muss, um die biologische Varianz besser abschätzen zu können, dasselbe Experiment mehrmals wiederholt werden.

13 TOF TOF MS/MS Precursor Spec #1=>BC=>SM5=>SM5[BP = 72.1, 1818] TOF TOF MS/MS Precursor Spec #1=>BC=>SM5=>SM5[BP = 72.1, 1818] 1.2 Verfahren der differenziellen Proteomanalyse 5 2D-Gelektrophorese/ Massenspektrometrie (2DE-MS) Isotopenmarkierung (ICAT-Methode) Probe 1 Probe 2 Probe 1 Probe 2 Modifikation mit ICAT Probenvorbereitung leicht vereinen, verdauen schwer Affinitätschromatographie 2DE (Proteine) MDLC (Peptide) Probentrennung Quantifizierung Bildverarbeitungssoftware Massenspektrometrie (MS) Identifizierung % Intensity % Intensity Mass (m/z) Mass (m/z) MS (Peptide Mass Fingerprint) MS/MS (MS-Sequenzierung) Nur MS/MS (MS-Sequenzierung) Bild 1.2 Schematische Darstellung der derzeit populärsten Ansätze für die differenzielle Proteomanalyse. Bei dem 2D-Gelelektrophorese / Massenspektrometrie (2DE-MS) Verfahren werden die zwei zu vergleichenden Proben einzeln mittels der zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) aufgetrennt und die erhaltenen Proteinmuster quantitativ verglichen. Unterschiedlich konzentrierte Proteinspots werden abschließend massenspektrometrisch mit Hilfe der Peptide Mass Fingerprint (PMF) oder der MS-Sequenzierung (MS/MS) Technik identifiziert. Beim der Isotopenmarkierung (ICAT-Methode) wird zunächst eine Probe mit der leichten und die andere mit der schweren Version eines isotopenhaltigen Reagenzes umgesetzt. Die Proteingemische werden vereint, enzymatisch gespalten, die modifizierten Peptide mittels Affinitätschromatographie isoliert und über mehrdimensionale Flüssigkeitschromatographie (MDLC) aufgetrennt. Aufgrund des Massenunterschieds zwischen dem leichten und schweren Reagenz erscheinen identische Peptide aus den beiden zu vergleichenden Proben als Massenpaare im MS-Spektrum. Die Quantifizierung erfolgt über den Vergleich der Signalintensitäten. Unterschiedlich konzentrierte Peptide werden abschließend mittels MS- Sequenzierung (MS/MS) und Datenbanksuchen identifiziert.

14 6 1 Einleitung Zum momentanen Zeitpunkt steht eine Fülle unterschiedlicher Analyseverfahren zur Verfügung, die aber noch nicht das Potential haben, komplette Proteome vollständig und quantitativ zu analysieren. Aus diesen zahlreichen Strategien haben sich mittlerweile zwei Ansätze, die sich im Wesentlichen in der Probenauftrennung und Proteinquantifizierung unterscheiden, für eine differentielle Proteomanalyse durchsetzen können (Bild 1.2): Zweidimensionale-Gelelektrophorese / Massenspektrometrie (2DE-MS)-Ansatz Bei der inzwischen gut etablierten und deshalb sehr häufig verwendeten 2DE-MS Technik (Bild 1.2) werden die Proteine der beiden Proben (Probe 1 + 2) jeweils einzeln mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt, angefärbt und schließlich mit Hilfe von Bildverarbeitungssoftware nach ihrer Färbungsintensität quantifiziert [Klose et al., 22, Wildgruber et al., 22, Tebbe et al., 25]. Mittlerweile existieren hoch entwickelte Computerprogramme, die in der Lage sind, automatisch hunderte von 2D- Gelen zu vergleichen und deren einzelne Proteine zu quantifizieren. Bei einer differenziellen Proteomanalyse werden anschließend nur diejenigen Proteine weiter analysiert, die Konzentrationsunterschiede zwischen den einzelnen Proben zeigen. Dazu wird das entsprechende Protein aus dem Gel ausgeschnitten, mit einem Enzym in Peptide gespalten und mit Hilfe der Massenspektrometrie analysiert. Sehr einfach und schnell kann ein Protein durch die Bestimmung der Massen seiner Peptide identifiziert werden (Peptide Mass Fingerprint (PMF)) [Cottrell, 1994, Pappin 1997]. Konnte das Protein mittels PMF nicht identifiziert werden oder soll das Ergebnis nochmals bestätigen werden, kann anschließend noch eine MS/MS-Messung (MS-Sequenzierung) [Steen und Mann, 24] durchgeführt werden. Hierbei wird ein einzelnes Peptid im Massenspektrometer in charakteristische Fragmente zerschlagen und dessen Aminosäuresequenz bestimmt. Die Proteinidentifizierung erfolgt anschließend durch einen Abgleich mit Proteindatenbanken mittels entsprechender Computeralgorithmen [Perkins et al., 1999, Sadygov et al., 24] Isotopenmarkierung / Multidimensionale Flüssigkeitschromatographie / Tandem Massenspektrometrie (ICAT)-Methode Mit dem erst kürzlich entwickelten Isotopenmarkierung (Bild 1.2) konnten einige Einschränkungen des 2DE/MS-Ansatzes behoben werden [Hoving et al., 22, Patton et al., 22]. Bei diesem Ansatz werden die Proteine der beiden Proben zunächst mit zwei unterschiedlich schweren isotopenhaltigen Reagenzien modifiziert, vereint und enzymatisch gespalten. Die erhaltenen Peptide werden über mehrdimensionale Flüssigkeitschromatographie (MDLC) aufgetrennt und mittels Massenspektrometrie quantifiziert (MS) und identifiziert (MS/MS) [Gygi et al., 1999, Chakraborty und Regnier, 22, Ross et al., 24]. Gerade aufgrund der besseren Automatisierbarkeit

15 1.2 Verfahren der differenziellen Proteomanalyse 7 besitzt dieses Analyseverfahren ein deutlich größeres Potential, die Basis für Hochdurchsatzanalysen zu werden, als die herkömmliche 2DE/MS-Methode. Wegen der großen Popularität existieren von dem Isotopenmarkierungsverfahren mittlerweile zahlreiche unterschiedliche Methoden [Moritz und Meyer, 23], was eine generelle Beschreibung der Vorgehensweise schwierig macht. Die Vor- und Nachteile der einzelnen Analyse-Techniken werden ausführlich in Abschnitt 1.4 diskutiert. Das Prinzip dieses Analyseverfahrens soll deshalb anhand der ersten, im Jahre 1999 entwickelten Isotope-Coded Affinity Tag (ICAT)-Methode [Gygi et al., 1999] erläutert werden. Das Herzstück dieses eleganten Ansatzes ist das verwendete Reagenz (Bild 1.3). Es existiert in einer leichten (X = Wasserstoff) und einer schweren (X = Deuterium) Version. Das ICAT-Reagenz kann in drei Bereiche geteilt werden: dem Biotin, zur Affinitätsaufreinigung der modifizierten Peptide; eine Linker-Region, die die Isotopen enthält; und eine reaktiven Gruppe, die spezifisch an Cysteine bindet. X = 1 H (Leichte Version) X = 2 H (Schwere Version) Biotin Linker Cystein reaktive Gruppe Bild 1.3 Struktur des ICAT-Reagenzes. Das Reagenz besteht aus drei Teilen: (1) Einer Affinitäts-Region (Biotin), die zur Isolation der modifizierten Peptide dient, (2) einer Linker- Region, die mit stabilen Isotopen angereichert ist und (3) einer reaktiven Gruppe, die spezifisch an Cysteine bindet. Das Reagenz gibt es in einer schweren (enthält acht Deuteriumatome ( 2 H)) und leichten (enthält keine Deuteriumatome) Version. Das Prinzip der ICAT-Methode ist in Bild 1.2 dargestellt. Zwei zu vergleichende Proteinproben werden zunächst getrennt voneinander bearbeitet. Als erstes werden alle Disulfidbrücken der Proteine mit Hilfe eines Reduktionsmittels gespalten. Die entstandenen freien Thiolgruppen der Cysteine werden anschließend mit dem ICAT- Reagenz (Bild 1.3) isotopenmarkiert, wobei Probe 1 mit der leichten und Probe 2 mit der schweren Version derivatisiert wird. Nach der Modifikation werden beide Proben vereint und enzymatisch in Peptide gespalten. Einige dieser Peptide enthalten die Aminosäure Cystein und tragen nun das ICAT-Reagenz. Diese können mittels Avidin- Affinitätschromatographie (Avidin-Biotin-Affinität) von den nicht markierten Peptiden isoliert werden. Die so gewonnen modifizierten Peptide können je nach Probenkomplexität noch chromatographisch aufgetrennt werden, bevor sie

16 8 1 Einleitung massenspektrometrisch vermessen werden. Als erstes wird ein normales MS-Spektrum der Probe aufgenommen. Durch die unterschiedliche Anzahl an schweren Isotopen erscheinen identische Peptide, die aus beiden Proben stammen, als Massenpärchen mit einem Abstand von acht Dalton (Da) pro Cystein. Anhand der Signal-Intensitäten eines Isotopenpärchens kann das relative quantitative Verhältnis berechnet werden. Die gleichartigen, aber unterschiedlich markierten Proteine verhalten sich bei allen Auftrennungsschritten und bei der enzymatischen Spaltung absolut identisch. Somit entspricht das quantitative Verhältnis eines Peptidpaares auch dem Mengenverhältnis seines Proteins in den beiden zu vergleichenden Proben. Die detektierten und quantifizierten Peptidpärchen werden anschließend mittels Tandem Massenspektrometrie (MS/MS) und einer Datenbanksuche identifiziert Vor- und Nachteile der beiden Analyseverfahren Wesentliche Vorteile der ICAT-Methode gegenüber dem 2DE-MS Ansatzes sind: Bessere Reproduzierbarkeit Genauere Quantifizierung Höherer dynamischer Bereich (Identifizierung niedrig exprimierter Proteine neben hoch konzentrierten Proteinspezies) Analyse von hydrophoben Membranproteinen Erleichterte Messung von sehr basischen, sauren, kleinen und großen Proteinen Leichter zu automatisieren Vorteile des 2DE-MS Verfahrens sind dagegen: Sehr gut etablierte Technik Deutlich höheres Trennvermögen der zweidimensionalen Gelelektrophorese Relativ niedrige Anschaffungskosten Bessere Detektion und Bestimmung von posttranslationalen Modifikationen Gerade die zuletzt genannte Analyse von posttranslationalen Modifikationen hat dazu beigetragen, dass die ICAT-Methode den 2DE-MS Ansatz nicht verdrängen konnte.

17 1.3 Durchführung einer differentiellen Proteomanalyse und Methodische Grundlagen Durchführung einer differentiellen Proteomanalyse und Methodische Grundlagen Grundsätzlich können beide Analyseverfahren in die gleichen Einzelschritte untergliedert werden: 1. Festlegung der Fragestellung und exakte Definition der Ausgangsbedingungen für die Proteomanalyse 2. Probenvorbreitung 3. Trennung der Proteinproben 4. Quantifizierung der Proteine* 5. Massenspektrometrie (MS) 6. Bioinformatik * Dabei ist zu beachten, dass bei der ICAT-Methode die Quantifizierung erst nach der Massenspektrometrie (MS) durchgeführt werden kann Festlegung der Fragestellung und exakte Definition der Ausgangsbedingungen für die Proteomanalyse Für die Auswahl der besten Methodik für eine differentielle Proteomanalyse sind eine Festlegung der Fragestellung und eine genaue Definition der Ausgangsbedingungen von wesentlicher Bedeutung. Am Ende sollen über die Analyse von Unterschieden zwischen den Proteinmustern der zu vergleichenden Proben diejenigen Proteine bestimmt werden, die an biologischen Reaktions- und Regelmechanismen beteiligt sind. Grundsätzlich gilt, dass die Schwierigkeit, aus Veränderungen funktionelle Rückschlüsse ziehen zu können, mit der Anzahl veränderter Proteine stark zunimmt. Daher sollten die Unterschiede zwischen den einzelnen Zuständen einer Proteomanalyse nicht zu groß gewählt werden, um eine sinnvolle Aussage treffen zu können [Lottspeich, 1999]. Daher gilt es vorab einige Punkte zu beachten: Welche Proteine sind beteiligt? Steht beispielsweise fest, dass hauptsächlich Membranproteine zur Aufklärung des biologischen Vorgang von Interesse sind, sollte die Probe nicht mit der 2DE getrennt werden. Denn mit dieser Methode können hydrophobe Proteine nur sehr schlecht analysiert werden [Klein et al., 25]. Im Gegensatz dazu, ist die quantitative Analyse von Membranproteinen mithilfe der ICAT Technik möglich [Han et al., 21]. Ähnliches gilt für sehr basische, saure, große und kleine Proteine.

18 1 Einleitung Sind posttranslational modifizierte Proteine zu untersuchen? Diese können besser mit dem 2DE-MS Ansatz detektiert und charakterisiert werden. Ein weiterer Faktor stellt der betriebene Aufwand und die damit verbundenen Kosten einer Proteomanalyse dar. Da eine (annähernd) vollständige Proteomanalyse (wenn überhaupt möglich) sehr arbeits- und kostenintensiv ist, sollte versucht werden, die Untersuchung auf eine bestimmte Gruppe von Proteinen zu beschränken (z.b. Analyse von einzelnen Organellen). Wie viele Proben sind zu vergleichen? In einer typischen differentiellen Proteomanalyse weist meist nur ein kleiner Anteil der Proteine Konzentrationsunterschiede zwischen den beiden zu vergleichenden Proben auf. Bei der 2DE-MS Methode können viele Proben parallel aufgetrennt und Mengenveränderungen einzelner Proteine über den Vergleich der erhaltenen Proteinmuster schnell bestimmt werden. Dadurch ist es möglich, auch bei einer hohen Probenanzahl die zeitaufwendige massenspektrometrische Analyse auf die wenigen, informationsreichen regulierten Proteine zu beschränken. Dagegen müssen bei der ICAT Technik alle Peptide massenspektrometrisch vermessen werden, um eine quantitative Aussage treffen zu können. Wie viel Probenmaterial steht zur Verfügung? Meistens ist die Menge an Proben bei biologischen Experimenten limitiert und man benötigt deshalb möglichst empfindliche Analysetechniken. Neuere Untersuchungen mit der ICAT Strategie haben gezeigt, dass man eine Proteomanalyse schon mit. Zellen durchführen kann. [Zang et al., 24] Vergleichbare Studien mit der 2DE-MS Methodik benötigen deutlich mehr Material [De Souza et al., 24]. Welches Analyseverfahren letztendlich die besseren Ergebnisse liefert, muss im Einzelnen getestet und die Methodik an die jeweilige Probe angepasst werden. Zurzeit kann eine maximale Ausbeute an Informationen bei einer differenziellen Proteomanalyse nur durch die Kombination beider Ansätze erzielt werden Probenvorbereitung Die Probenvorbereitung dient dazu, die Proteine der zu untersuchenden Proben für die anschließende Auftrennung vorzubereiten. Sie ist der erste essentielle Schritt jeder Proteomanalyse. Aufgrund der hohen Sensitivität der Proteinexpression gegenüber äußeren Einflüssen, sollten möglichst sämtliche experimentellen Parameter erfasst und konstant gehalten werden. Nur dann ist es möglich, die quantitativen Verhältnisse zwischen den einzelnen Proben richtig beurteilen zu können. Außerdem sollte bei relativ niedrigen Temperaturen und unter Einsatz von Proteaseinhibitoren gearbeitet werden, um einen Proteinabbau durch probeneigene Proteasen zu verhindern.

19 1.3 Durchführung einer differentiellen Proteomanalyse und Methodische Grundlagen 11 Eine große Herausforderung ist es, alle Proteine vollständig in Lösung zu bringen. Dies ist vor allem wegen den stark unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften der Proteine außerordentlich schwierig. Besondere Probleme bereiten Membranproteine, die aufgrund der hohen Hydrophobizität nach der Isolierung aus der Membran sehr leicht in wässrigen Lösungsmitteln aggregieren und somit unlöslich werden. Dies kann nur durch Zugabe von chaotrophen Verbindungen wie Harnstoff oder Guanidin-hydrochlorid und Detergenzien verhindert werden. Allerdings können diese Stoffe die folgende Proteintrennung stark beeinflussen oder zu ungewollten Modifikationen (z.b. Carbamoylierung) einzelner Proteine führen. Es ist also so gut wie unmöglich, eine allgemein gültige Vorschrift zur Solubilisierung aller Proteine sämtlicher Proben zu erstellen. Vielmehr muss die Probenvorbereitung im Hinblick auf die Fragestellung individuell optimiert werden. Eine ganz entscheidende Vorrausetzung für eine erfolgreiche Analyse mit der ICAT- Methode ist eine spezifische und quantitative ablaufende Isotopenmarkierung aller Cysteine der Proteine. Sämtliche Nebenreaktionen oder unvollständigen Markierungen würden die ohnehin schon hohe Komplexität der Probe zusätzlich erhöhen und damit die Auftrennung der Probe deutlich aufwendiger gestalten. Im Gegensatz zum 2DE-MS Verfahren werden bei der ICAT-Methode die vereinten und isotopenmarkierten Proteinproben vor der anschließenden Auftrennung enzymatisch in Peptide gespalten Trennung der Proteinproben Die Trennung der Proteinproben hat das Ziel, deren Komplexität so weit zu reduzieren, dass eine massenspektrometrische Bestimmung der enthaltenen Proteine möglich ist. Dabei erfolgt die Probentrennung bei den beiden Analyseverfahren mit zwei unterschiedlichen Techniken. Bei dem 2DE-MS Verfahren werden die Proteine der Proben mit Hilfe der zweidimensionale Gelelektrophorese (2DE) aufgetrennt, wohingegen bei der ICAT-Strategie die nach einer enzymatischen Spaltung erhaltenen Peptide der Proteinproben mittels mehrdimensionaler Flüssigkeitschromatographie (MDLC) getrennt werden. Die Auftrennung komplexer Proteingemische in Ihre Komponenten stellt immer noch eines der Hauptprobleme bei einer Proteomanalyse dar. Man geht davon aus, dass in humanen Zellen trotz der nur Gene bis zu unterschiedliche Proteinspezies vorkommen [Pandey und Mann, 2]. Die hohe Anzahl ist hauptsächlich auf das Auftreten von Proteinmodifikationen, Proteinabbau, Proteinisoformen und Splicingvarianten zurückzuführen. Zudem können die Konzentrationen der in einer Probe vorhandenen Proteine um einen Faktor 6 oder mehr variieren [Anderson et al., 22]. Bei einer differentiellen Proteomanalyse von komplexen Proteingemischen finden deshalb nur gekoppelte, mehrdimensionale, hochauflösende Trennmethoden Verwendung, wie die 2DE und die MDLC.

20 12 1 Einleitung Zweidimensionale Gelelektrophorese Ein wichtiger Meilenstein der Proteinanalytik stellte sicherlich die Entwicklung der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2DE) im Jahre 1975 durch Klose und O Farrel dar [Klose, 1975, O Farrel, 1975]. Dabei werden die Proteine als erstes über eine isoelektrische Fokussierung (IEF) nach ihrem isoelektrischen Punkt (pi), und in einem zweiten Schritt mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- PAGE) nach ihrer Masse getrennt. Bild 1.4 zeigt ein typisches Proteinmuster, das nach der Trennung und Färbung der Proteine eines komplexen humanen Proteoms entsteht. Allgemein werden bei der Elektrophorese Substanzen aufgrund ihrer unterschiedlichen Mobilität in einem angelegten elektrischen Feld aufgetrennt. Bei der IEF wandern die einzelnen Proteine in einem ph-gradienten zu jenem Bereich, der ihrem pi entspricht. Denn dort tragen Proteine, die einen zwitterionischen Charakter aufweisen, keine Ladung mehr und können in einem elektrischen Feld nicht mehr wandern. Sollte sich das Protein durch Diffusion dennoch aus dem ph-bereich seines pis entfernen, erhält es eine Ladung und wandert wieder zurück zu dem ph-bereich, der mit dem pi übereinstimmt. Die IEF ist also eine konzentrierende Endpunktsmethode, bei der sich sehr scharfe, hochkonzentrierte Proteinbanden bilden. Bei der anschließenden 1. Dimension SDS-PAGE werden alle kda Proteine mit einem Überschuss an SDS behandelt, das sich an die Proteine anlagert und mit MW diesen so genannte SDS- Protein-Komplexe bildet. Damit sind alle Proteine negativ geladen und wandern in einem elektrischen Feld in 6 kda die gleiche Richtung, 4 pi 7 nämlich zur Anode. Die Bild 1.4 Typisches zweidimensionales Gel des Proteoms Trennung der einzelnen von HEP-G2 Zellen im ph-wert-bereich 4-7. MW = Proteine erfolgt hierbei nur Molekülmasse; pi = Isoelektrischer Punkt. aufgrund ihrer Größe (d.h. ihrer Molekülmasse). Mit Hilfe dieser Methode war es schon im Jahre 1975 möglich, einzelne Proteine aus kompletten Proteomen von Zellen, Geweben oder Körperflüssigkeiten zu trennen. Nach dem Anfärben der aufgetrennten Proteine (z.b. Silber- oder Coomassie-Färbung) konnten für die jeweiligen Proben spezifische Proteinmuster erstellt und quantitativ verglichen werden. Dies erlaubte die Bestimmung von Konzentrationsunterschieden einzelner Proteinspezies zwischen verschiedenen Zuständen (z.b. normal gegen pathologisch). Allerdings können erst seit einigen Jahren durch die Entwicklung von 2. Dimension

21 1.3 Durchführung einer differentiellen Proteomanalyse und Methodische Grundlagen 13 immobilisierten ph-gradienten (IPG) für die IEF [Bjellqvist et al., 1982] und neuen Auftragsmethoden [Rabilloud et al., 1994, Sanchez et al., 1997] die für eine akkurate Quantifizierung nötigen, reproduzierbaren Proteinmuster erstellt werden. Der sehr hohen Trennleistung der 2DE von mehren tausend Proteinen [Görg, 24] stehen auch einige gravierende Nachteile, wie geringer dynamischer Bereich, schlechte Automatisierbarkeit und Reproduzierbarkeit, aufwändige technische Umsetzung und der Verlust ganzer Proteinklassen, wie hydrophober, sehr basischer, sehr saurer, sowie großer und kleiner Proteine gegenüber Mehrdimensionale Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie Bei der mehrdimensionalen Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (MDLC) erfolgt eine Trennung der Probe aufgrund der unterschiedlichen Wechselwirkung der einzelnen Protein-/Peptidmolekülen mit der chromatographischen Oberfläche, der stationären Phase. Da die Adsorption von ganzen Proteinen an die chromatographische Oberfläche von vielen Faktoren beeinflusst wird (z.b. Gesamtproteinkonzentration der Probe, individuelle Eigenschaften eines Proteins etc.) und auch irreversibel ablaufen kann, ist eine reproduzierbare Trennung von Proteingemischen äußerst schwierig. Deshalb werden komplexe Proteinproben vor ihrer chromatographischen Trennung zuerst in kleinere Peptide gespalten, die weitaus weniger heterogene Eigenschaften als ganze Proteine aufweisen und deswegen mit einzelnen Analysemethoden besser zu erfassen sind. Aufgrund der kleineren Masse besitzen Peptide zudem andere physikalisch-chemische Eigenschaften (z.b. Diffusionskoeffizient) als Proteine und sind deshalb leichter chromatographisch zugänglich. So können Trennungen mit einer deutlich höheren Reproduzierbarkeit durchgeführt werden. Wegen der hohen Komplexität erfolgt die Auftrennung von Peptidgemischen fast immer mit Hilfe von mehrdimensionalen chromatographischen Trennungen. Am häufigsten wird eine Kombination aus Ionenaustausch- und Umkehrphasen- Chromatographie verwendet [Link et al., 1999]. Mit dieser Technik war man sehr schnell in der Lage, mehrere tausend Peptide aus einer Probe zu trennen [Kislinger et al., 23, Peng et al., 23]. Ferner konnte gezeigt werden, dass hier auch Peptide von sehr hydrophoben [Wu und Yates, 23], sehr basischen [Washburn et al., 21] und sehr niedrig exprimierten Proteinen aufgetrennt werden können [Gygi et al., 22]. Trotzdem reicht die Trennleistung dieser multidimensionalen chromatographischen Techniken noch nicht aus, um komplexe Proteome von höheren Organismen vollständig aufzulösen. Beispielsweise führt die Spaltung sämtlicher humaner Proteine mit dem Enzym Trypsin zu ca. zwei Millionen individuellen Peptiden. Tatsächlich können derzeitige zweidimensionale chromatographische Systeme nur mehrere zehntausend Peptide trennen [Washburn et al., 21]. Im Vergleich dazu ist die 2DE in der Lage bis zu. der insgesamt Proteinspezies eines komplexen Proteoms aufzutrennen [Görg et al., 24]. Sie ist daher für die Trennung kompletter Zelllysate besser geeignet.

22 14 1 Einleitung Um die Anzahl der zu trennenden Peptide zu reduzieren, werden deshalb häufig die Proteinproben vor ihrer chromatographischen Trennung in einzelne Fraktionen aufgeteilt. Dies kann mit verschiednen Verfahren erreicht werden, wie der Untersuchung einzelner Zellorganelle [Kislinger et al., 23], der Isolation bestimmter Peptidklassen [Liu et al, 25, Gevaert et al., 22] oder der Verwendung einer weiteren Trenndimension [Stasyk und Huber, 24, Righetti et al., 22] Quantifizierung der Proteine Wie auch die Methoden der Trennung, unterscheidet sich die Vorgehensweise der Quantifizierung zwischen dem 2DE/MS-Ansatz und dem ICAT-Verfahren grundlegend voneinander. Bei der 2DE/MS-Methode werden die Konzentrationen der einzelnen Proteine in den beiden Proben aufgrund deren Färbungsintensität bestimmt und verglichen. Bei der ICAT-Strategie erfolgt dagegen die Quantifizierung erst nach der massenspektrometrischen Analyse im MS-Spektrum durch den Vergleich der Signalintensitäten eines Isotopenpaares (Bild 1.2). Für einen quantitativen Vergleich einzelner Proteinspezies mittels 2DE/MS ist es zunächst nötig, die durch 2DE aufgetrennten Proteine sichtbar und damit detektierbar zu machen. Hierfür finden vor allem die sehr empfindliche Silberfärbung und die weniger sensitiven Färbungen mit dem Triphenylmethanfarbstoff Coomassie Blue Anwendung. Ein für die Quantifizierung wichtiger Aspekt stellt die Linearität der Färbung dar, die aufgrund von Sättigungseffekten sehr begrenzt ist und maximal über zwei Größenordungen reicht [Lottspeich, 1999]. Um den breiten dynamischen Konzentrationsbereich der Proteine bei einer Proteomanalyse abzudecken, müssen mehrere Gele mit unterschiedlichen Probenmengen hergestellt werden. Denn nur Proteine, deren Konzentrationen unterhalb des Sättigungsbereichs liegen, eignen sich für eine genaue Quantifizierung. Für die Bestimmung quantitativer Veränderungen einzelner Proteinspezies zwischen mehreren Proteinmustern stehen inzwischen hoch entwickelte Computerprogramme zur Verfügung, die sehr schnell und automatisch hunderte von Gelen vergleichen, normieren und auswerten können. Allerdings kann auch mit dieser Hilfe die hohe Varianz zwischen einzelnen 2D-Gelen nicht vollständig ausgeglichen werden und man muss für eine sichere Quantifizierung einzelner Proteine arbeits- und probenintensive Mehrfachbestimmungen einzelner Proben durchführen. Im Gegensatz dazu ist die Quantifizierung einzelner Proteine mit einer Standardabweichung von weniger als % bei der ICAT-Methode sehr viel exakter als bei dem 2DE-MS Ansatz. Diese hohe Genauigkeit der Quantifizierung ist darauf zurückzuführen, dass zum einen die Mengenbestimmung im MS-Spektrum durchgeführt wird und dabei kaum Sättigungseffekte wie bei der Färbung auftreten. Dadurch wird eine Linearität von über vier Größenordnungen erzielt [Patton et al., 22]. Zum anderen werden die zu vergleichenden Proben nach der Isotopenmarkierung zu einem sehr frühen Zeitpunkt vereint, weshalb in den anschließenden Arbeitsschritten nur noch eine Probe weiter analysiert werden muss. Dabei werden die quantitativen

23 1.3 Durchführung einer differentiellen Proteomanalyse und Methodische Grundlagen 15 Verhältnisse eingefroren, d.h. selbst wenn bei der Aufarbeitung der Probe Verluste auftreten, bleiben die quantitativen Verhältnisse der einzelnen Isotopenpaare erhalten. Deshalb sind diese Methoden, im Gegensatz zu der 2DE basierenden Methode, bei der die Proben vor der Quantifizierung einzeln aufgetrennt werden müssen, sehr viel reproduzierbarer und akkurater Massenspektrometrie Die Massenspektrometrie dient bei beiden Analyseverfahren zur Identifizierung der Proteine und wird bei der ICAT-Methode auch zur Quantifizierung eingesetzt (Bild 1.2). Aufgrund der hohen Empfindlichkeit und Geschwindigkeit hat sich die Massenspektrometrie (MS) mittlerweile zum Mittel der Wahl für die Proteinidentifizierung und seit kurzem auch der Proteinquantifizierung in der Proteomik etabliert. Allerdings konnte sie erst vor 15 Jahren ihren Siegeszug in der Bioanalytik feiern. Dies hatte seinen Grund in der Entwicklung sehr sanfter Ionisierungstechniken, der Elektrospray-Ionisierung (ESI) [Fenn et al., 1989] und der Matrix-unterstützten Laserdesorption/Ionisation (MALDI) [Hillenkamp et al., 1991], durch die man nun in der Lage war, auch Biomoleküle massenspektrometrisch zu analysieren. Für diese bedeutenden Errungenschaften wurden Fenn und Tanaka im Jahre 22 mit dem Chemie Nobelpreis ausgezeichnet Prinzip Mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS) kann die Molekülmasse freier Ionen im Hochvakuum bestimmt werden. Ein Massenspektrometer besteht grundsätzlich aus 3 Komponenten: einer Ionenquelle zur Ionenerzeugung (z.b. ESI, MALDI) einem Massenanalysator, in dem die Ionen beschleunigt und anschließend nach ihrem Masse/Ladungsverhältnis (m/z) aufgetrennt werden und einer Detektionseinheit, die die Ionen detektiert In der Proteomanalytik verwendete Ionenquellen Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) In den vergangenen Jahren hat sich die durch Karas und Hillenkamp [Hillenkamp et al., 1991] entwickelte Matrix-unterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) zu einer der wichtigsten Techniken der Molekülmassenbestimmung von Biomolekülen entwickelt [Aebersold und Mann, 23]. Das Prinzip von MALDI ist in Bild 1.5 (aus Lottspeich und Zorbas, 1998) dargestellt. Für eine MALDI-MS Messung wird zunächst die Probe mit einem gelösten

24 16 1 Einleitung Bild 1.5 Prinzip des MALDI-Prozesses. Hier wird die Probe mit einem Überschuss an Matrix gemischt, die ultraviolettes Licht absorbiert. Beim Beschuss mit einem fokussierten Laserimpuls einer bestimmten Wellenlänge sublimieren die Matrix-Moleküle und befördern so die Probe in die Gasphase. Die dabei entstehenden einfach geladenen Proben-Ionen werden abschließend durch eine angelegte Hochspannung Richtung MS beschleunigt. niedermolekularen Feststoff, der so genannten Matrix, vermischt. Bei den meisten verwendeten Matrices handelt es sich um organische Säuren (Tabelle 1.1, aus Kratzer, 21). Das molare Matrix- Analyt-Verhältnis sollte ca. 3 : 1 bis 4 : 1 betragen. Nach dem Verdunsten des Lösungsmittels kommt es zu einer Kokristallisation von Analyt und Matrix, wobei die Moleküle des Analyten in das Kristallgitter der Matrix eingebaut werden. Bei der anschließenden MALDI- MS Messung wird nun die Probe mehreren intensiven Impulsen kurzwelliger Laserstrahlung (je 3-4 ns) ausgesetzt, woraufhin die Probe aus der kristallinen Matrix sublimiert und ionisiert. Dabei ist die Wellenlänge des Lasers ist so gewählt, dass die Laserenergie von der Matrix absorbiert und durch Relaxation in das Festkörpergitter übertragen wird. Durch die resultierende explosionsartige Sublimation eines Teilbereichs der Festkörperoberfäche werden sowohl Proben- als auch Matrixmoleküle in die Gasphase überführt. Der Ionisationsvorgang ist dabei sehr schonend, so dass auch große und thermisch labile Biomoleküle, wie Proteine, intakt bleiben. Schließlich werden die gebildeten Ionen noch durch ein erzeugtes elektrostatisches Feld Richtung Massenanalysator/Detektor beschleunigt. Tabelle 1.1 Typische Matrixsubstanzen für die MALDI-MS in der Proteinanalytik.