Neue Methoden zum Nachweis von Verfälschungen
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- Nicole Hofmann
- vor 6 Jahren
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Transkript
1 Neue Methoden zum Nachweis von Verfälschungen Proteinanalytik mit LC-MS/MS
2 Augenscheinlich zuordenbare Rohstoffe 2
3 Rohstoffe/Verfälschungen nicht mehr erkennbar 3
4 Proteine in Büffel und Rind (wie Beta-Lactoglobulin) Büffel: WENGECAQK Mozzarella Beta-Lactoglobulin Rind: TPEVDDEALEK 4
5 Labor - Probenextraktion Probenvorbereitung homogenisieren vorbereiten (z.b. thermisch behandeln) entfetten durch Heißextraktion gefriertrocknen Proteine mit Harnstoff/TRIS-Pufferlösung extrahieren Zugabe von BSA (Serumalbumin) als internen Standard Zersetzung des störenden Harnstoffs durch Urease 5
6 Labor - In-Vitro-Verdauung Reduktion mit Dithiothreitol (DTT) => Disulfidbrücken lösen Alkylierung mit Iodacetamid (IA) => SH-Gruppen stabilisieren In-Vitro-Verdauung durch Trypsin (Spaltung am C-Ende von Lysin oder Arginin) 6
7 Recherche - Geeignete Proteine Datenbanksuche beispielsweise in Aminosäuresequenz (FASTA-File) als Grundlage für die Messmethode 7
8 In-Silico Verdauung der Proteine Aus Aminosäuresequenz (FASTA-File) Peptide berechnen Precursor- und Produkt-Ionenmassen ableiten LC-MS/MS Messmethode erstellen Alpha-S2-casein: MKFFIFTCLLAVALAKNTMEHVSSSEESIISQETYKQEKNMAINPSKENLCSTFCKEVVRNANEEEYSIGSSSEESAEVATEEVKITVDDKHYQKALNEI NQFYQKFPQYLQYLYQGPIVLNPWDQVKRNAVPITPTLNREQLSTSEENSKKTVDMESTEVFTKKTKLTEEEKNRLNFLKKISQRYQKFALPQYLKTV YQHQKAMKPWIQPKTKVIPYVRYL Precursor: ALNEINQFYQK m/z (++) (C13: m/z , mit %) Produkt-Ionen: b y SEQ A AL ALN ALNE ALNEI ALNEIN ALNEINQ ALNEINQF ALNEINQFY ALNEINQFYQ ALNEINQFYQK 8
9 Messung und Auswertung Messung (LC-MS/MS, MassHunter) mit der in SkyLine erstellten Messmethode Auswahl der geeigneten Fragmente, festlegen der Retentionszeiten Erstellen einer dynamische MRM-Methode für die Untersuchung mehrerer Peptide (Response/Empfindlichkeit vs. Selektivität) MassHunter: 2015 Agilent Technologies; SkyLine: 9
10 Eingesetzte Software MassHunter (LC-MS/MS Agilent) ProteinDB Skyline 10
11 Auswertung - Screening Retentionszeit mit internem Standard korrigieren Summe aller nachgewiesenen Proteine auf 100% normieren Das Ergebnis gibt den relativen Anteil der einzelnen Spezies basierend auf allen nachgewiesenen Proteinen an. 11
12 Auswertung - Quantifizierung Retentionszeit korrigieren und Signale mit int. Standard normieren Auswertung mit einer Eichkurve (Protein in neutraler Matrix) Mandel ( mg/kg) Die Angabe der Konzentration bezieht sich auf den Gehalt im Lebensmittel. 12
13 Methodenerstellung - aus der Theorie in die Praxis Auswahl des Proteins In-Silico-Verdauung => Peptide BLAST-Search (Basic Local Alignment Search Tool) zur Überprüfung der Eindeutigkeit der Peptide Berechnung der Precursormassen und Fragmente (SkyLine) Messung und Auswahl der geeigneten Fragmente (LC-MS/MS, SkyLine) Beispielhaft: Alpha-S2-Casein In-Silico-Verdauung => ALNEINQFYQK BLAST-Search 26 Treffer Precursormasse: m/z (++) Fragmente: m/z , m/z , m/z Einpflegen in Datenbanken, Eichkurven etc. (ProteinDB) 13
14 Datenauswertung - in der Praxis Messung der vorher festgelegten Proteine Identifikation über Precursor-Ionen, Fragmente und Retentionszeit Quantifizierung über normierte Proteinverhältnisse oder Eichkurven Achtung: Proteine mit ähnlicher AS-Sequenz! nicht unterscheidbare Precursor-Ionen und ähnliche Fragmente vergleichbare Retentionszeit. Precursor: m/z (++) (SwissProt) => 1738 Treffer +/- 0.1 u => 441 Treffer +/ u => 66 Treffer +/ u Identische Precursormasse m/z (++) 684 u Casein-S2 P02663 (div. Tiere) ALNEINQFYQK m/z 940, 827, 713 FOLC_BACSU Q05865 ENIAHISDEALR m/z 940, 803, 690 Cytochrom P450 m/z 975, 846, 733, 620 ARGD_SYNY3 m/z 962, 865, 764 CYSJ_PHOLL m/z 1041, 927, 814 DNAG_STAAC m/z 1040, 893,
15 Absicherung der Ergebnisse Falsch-negative Befunde (beispielsweise Kuhmilch in Büffelmozzarella nicht gefunden, obwohl vorhanden) sind unwahrscheinlich wenn: interner Standard und Matrixpeptide nachgewiesen werden der Analyt in signifikanter Konzentration innerhalb des Arbeitsbereichs vorliegt die Methode durch Dotierungsversuche überprüft wurde Positiv Befunde (beispielsweise Kuhmilch im Büffelmozzarella gefunden) absichern durch: den Nachweis von weiteren, spezifischen Proteinen Messung mittels MRM3- Modus (zukünftige Methodenentwicklung) Verwendung anderer Verdauungsenzyme weitere Untersuchungsmethoden zur Bestätigung 15
16 Untersuchungsserien Büffelmozzarella: Bei 47 Proben 1 Auffälligkeit Haselnüsse: Bei 35 Proben 2 Auffälligkeiten, 1 Besonderheit Dotierungen: Dotierung [Gew-%] Screening [Prot-%] 2% Mandel 1,2% 5% Mandel 4,9% 10% Mandel 9,7% 5% Erdnuss 10,2% Dotierung von Haselnüssen mit Mandeln/Erdnüssen Dotierung [Gew-%] Screening [Prot-%] 5% Rind 4,80% 10% Rind 9,20% 25% Rind 16,40% Dotierung von Büffelmozzarella mit Rindermozzarella Nuss Eiweißgehalt Haselnuss 12% Mandel 18% Erdnuss 25% Eiweißgehalt von Nüssen 16
17 Mein Dank an - die Mitarbeiter im Labor - die Kollegen und Ihnen für Ihre Aufmerksamkeit! 17
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