Identifikation von Proteinen anhand von MS/MS-Fragmentspektren

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1 Identifikation von Proteinen anhand von MS/MS-Fragmentspektren Studienarbeit August 2006 Autor Alexander Haupt, Humboldt-Universität zu Berlin Betreuer Prof. Ulf Leser, Humboldt-Universität zu Berlin Dr. Christian Scheler, Proteome Factory AG, Berlin

2 Übersicht Das Wissen darum, welche Proteine in biologischen Proben vorhanden sind und welche nicht, stellt einen Schlüsselfaktor sowohl in der biologischen Forschung als auch in der medizinischen Diagnostik dar. Durch die ständige Neu- und Weiterentwicklung technischer Geräte und Verfahren ist es heutzutage möglich, eine entsprechende Analyse innerhalb weniger Stunden durchzuführen. Im ersten Teil dieser Arbeit werden die wichtigsten Protein-Sequenzierungs- Verfahren und ihre zugrunde liegenden Techniken vorgestellt. In einem weiteren Abschnitt wird die während dieser Studienarbeit durchgeführte Implementation einer Web-Schnittstelle zur De-Novo-Sequenzierungssoftware SEQUIT der Proteome Factory AG beschrieben. Darüber hinaus wird eine Erweiterung SEQUITs vom einfachen Einzelplatz-Produkt zu einem serverbasierten System besprochen und ein Peak-Picking-Algorithmus für SEQUIT Online vorgestellt. 2

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einführung 4 2 Proteinanalyse anhand von Massenspektren Massenspektrometrie Massenspektrometer Ionisierungsmethoden Peptide Mass Fingerprinting Aufbereitung der Proteinproben Messung der Peptidmassen Datenbanksuche und Bewertung MS/MS Ionensuche Tandem-Massenspektrometrie Suchverfahren De-Novo-Sequenzierung Postprocessing Vergleich der Verfahren Web-Schnittstelle für SEQUIT Ist- und Bedarfsanylse Struktur von SEQUIT Online Web-Formular CGI-Skript Parser Datenbank Ergebnispräsentation Weiterentwicklung Peak-Picking-Algorithmus A Tabelle: Alle Aminosäuren und ihre Massen 28 B Webformular von SEQUIT Online 29 C SEQUIT Ausgabe der berechneten Peptide 30 D Ergebnispräsentation von SEQUIT Online 31 Abbildungsverzeichnis 32 Literatur 33 3

4 1 Einführung Als Proteom eines Organismus bezeichnet man die Gesamtheit aller in ihm vorkommenden Proteine einschließlich ihrer funktionalen Verknüpfungen. Die Proteomforschung versucht, Wissen über die Existenz, die Funktionen und die gegenseitigen Abhängigkeiten von Proteinen zu erlangen. Grundlage dieser Forschung ist das Wissen um die Existenz eines Proteins, erst danach kann man genauer seine Funktionen, Wechselwirkungen und Umgebungsfaktoren untersuchen, die sein Verhalten beeinflussen und steuern. Häufig sind diese Faktoren wiederum andere Proteine. Speziell in der medizinischen Forschung wird daher eine Frage besonders häufig gestellt: Welche Proteine befinden sich in meiner Probe? Die zu ihrer Beantwortung notwendige Analyse der Probe stützt sich auf ein eindeutiges Identifikationsmerkmal von Proteinen ihre Aminosäuresequenz. Mit dem Wissen über ihre Sequenz lassen sich Proteine leicht identifizieren und in der Probe nachweisen. Ein klassisches Identifizierungsverfahren ist die Edman-Degration 1, ein eher langsamer und aufwändiger Prozess. Eine andere, moderne Methode ist die Analyse der Proteinmassen mit Hilfe der Massenspektrometrie (MS). Obwohl das Prinzip der Massenspektrometrie schon seit fast hundert Jahren bekannt ist 2, konnte man es erst mit Hilfe moderner leistungsstarker Rechner effizient für die Proteinanalyse nutzen. Heute ist die Massenspektrometrie das dominierende Verfahren zur Analyse der Zusammensetzung von chemischen Verbindungen, nicht nur im Bereich der Proteinforschung. Aus den gewonnenen Daten können wichtige Sequenzinformationen über das Protein gewonnen werden, die eine direkte Berechnung der Aminosäuresequenz erlauben oder aber einen Vergleich mit den Spektrometriedaten bereits bekannter Proteine ermöglichen. Im folgenden Abschnitt werden die entsprechenden Verfahren vorgestellt. 1 Erstmals 1950 von dem schwedischen Biochemiker Pehr Edman angewandt von J.J.Thompson entdeckt 4

5 2 Proteinanalyse anhand von Massenspektren 2.1 Massenspektrometrie Massenspektrometer In einem klassischen Massenspektrometer werden Moleküle elektrisch geladen (ionisiert) und anschließend durch ein angelegtes elektrisches Feld beschleunigt und abgelenkt. Die Stärke der Beschleunigung und der Ablenkung hängt sowohl von der Feldstärke als auch von der Ladung und der Masse des Moleküls ab. Folglich lässt sich aus der Ladung des Moleküls und der Stärke der Ablenkung direkt die Molekülmasse berechnen. Da Massenspektrometer die Ladung q eines Moleküls nicht direkt messen können, geben sie die Masse m nicht direkt aus, sondern das Verhältnis der Masse zur Ladung m/q. Aufgebaut sind die Massenspektrometer prinzipiell aus drei Einheiten, einem Ionisator, einem Beschleuniger/Ablenker und einem Detektor, allerdings wurden im Laufe der Jahre vielfältige Varianten entwickelt. Heute unterscheidet man vor allem Sektorfeld-, Flugzeit- (TOF), Quadrupol- und Ionenfallen- Massenspektrometer. Während bei den Standard-Modellen die Ionisierung, die Analyse und die Detektion räumlich getrennt stattfindet, besitzen die Ionenfallen nur eine Kammer, in der die Ionisierung, ein optionaler Fragmentationsprozess, die Analyse und Detektion zeitlich nacheinander stattfinden. Unterschiede gibt es auch in der Art und Weise der Ionisierung der Moleküle. Von den verschiedene Methoden haben sich besonders die Elektrospray Ionisation (ESI) sowie die Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) für Proteine und Peptide bewährt. Beide stellen eine besonders sanfte Art der Ionisierung dar, bei der die Moleküle nicht zerstört oder fragmentiert werden. Abbildung 1: Beispiel eines Massenspektrums 5

6 2.1.2 Ionisierungsmethoden Bei der ESI werden die zu untersuchenden Moleküle in gelöster Form durch eine Kapillardüse innerhalb des Massenspektrometers geleitet. Dies geschieht bei normalem Druck und in Anwesenheit eines Trägergases, meist Stickstoff. Zwischen der Düse und einer weiteren Elektrode entsteht durch eine angelegte Spannung ein elektrisches Feld, das die in der Lösung befindlichen Ionen Richtung Elektrode drängt und zur Bildung eines instabilen Taylor-Kegels und seines typischen Jets anregt. Dieser dünne Flüssigkeitsstrahl zerstäubt und bildet ein feines, ionisiertes Aerosol. Durch das sukzessive Verdampfen des Lösungsmittels verringert sich die Größe der Aerosol-Tropfen, was zu einer Zunahme der Ladungsdichte an ihrer Oberfläche führt. Bei Überschreiten einer bestimmten Obergrenze dieser Ladungsdichte, dem Rayleigh-Limit, zerfallen die Tröpfchen aufgrund der inneren Abstoßungskräfte in noch kleinere Tröpfchen. Durch die nun insgesamt wieder größere Oberfläche bei unveränderter Ladung ist das Rayleigh-Limit wieder unterschritten und der Prozess beginnt erneut. Im Idealfall wiederholt er sich solange, bis nur noch einzelne Ionen übrig bleiben. Bei der MALDI werden die zu untersuchenden Moleküle in eine spezielle, Matrix genannte, Lösung eingebracht und kristallisieren mit dieser zusammen, sobald sich die Lösungsmittel verflüchtigen. Im Massenspektrometer wird diese Matrix als dünne Schicht auf einen Träger aufgetragen und durch Laserbeschuss ionisiert. Einen Teil der Ladung gibt sie an die Proben-Moleküle weiter, während sie diese außerdem vor dem für sie zerstörerischen Laser schützt. Gleichzeitig werden durch die zugeführte Energie ständig kleine ionisierte Fragmente der Matrix und der Proben-Moleküle losgelöst. 2.2 Peptide Mass Fingerprinting Als Peptide Mass Fingerprinting bezeichnet man eine Technik zur Proteinidentifikation, bei der einzelne Proteine erst in Peptidketten gespalten und diese anschließend in einem Massenspektrometer vermessen werden. Das resultierende Massenspektrum kann als Fingerprint des Proteins bezeichnet werden, da die Anzahl und einzelnen Massen der entstandenen Peptide ein Protein eindeutig identifizieren. Es kann anschließend eine automatische Suche nach ähnlichen Spektren in Proteindatenbanken erfolgen, um das untersuchte Protein zu identifizieren. 6

7 2.2.1 Aufbereitung der Proteinproben Um das Massenspektrum möglichst genau einem Protein zuzuordnen, sollten die in der Probe enthaltenen Proteine sauber voneinander getrennt werden. Dies ist ein wichtiger Faktor zur Vereinfachung des Identifikationsprozesses. So lässt sich sicherstellen, dass das erhaltene Spektrum möglichst nur von einem einzelnen Protein stammt. Werden mehrere Protein gleichzeitig analysiert, können sich Probleme durch mögliche Signalunterdrückung im Massenspektrometer ergeben. Die starken Signale des einen Proteins überdecken dann die schwächeren Signale des anderen. Ebenfalls ist eine spätere Zuordnung der zahlreichen Peptidketten zu den einzelnen Proteinen sehr schwierig bis unmöglich. Eine klassische Trennmethode für Proteine ist die Gel-Elektrophorese. Dabei wird die gesamte biologische Probe mit den enthaltenen Proteinen auf eine Trägersubstanz, dem Gel, aufgetragen. Durch die Wirkung eines angelegten elektrischen Feldes bewegen sich die Moleküle durch das Gel. Die Geschwindigkeit der Bewegung ist abhängig von der Größe der Moleküle und erlaubt damit bereits eine gute Trennung voneinander. Bei der zweidimensionalen Gel-Elektrophorese (2D-PAGE) hingegen wird zusätzlich nach einem weiteren Faktor getrennt, dem isoelektrischen Punkt. Er ist ein Maß für den Gehalt an sauren und basischen Aminosäureresten des Proteins. Durch diese zwei Dimensionen gelingt eine recht gute Trennung der Proteine auf dem Gel, wie man in Abbildung 2 gut erkennen kann. Wenn die Proteine möglichst gleichmäßig über das Gel verteilt sind, wird der Prozess gestoppt. Jeder Punkt, Spot genannt, repräsentiert dann im Idealfall genau ein Protein. Sind die Proteine zu ähnlich oder gab es Probleme, z.b. mit der Güte des Gels oder anderen Faktoren, so verschmieren die einzelnen Punkte und erlauben keine saubere Trennung mehr. Die Position des Spots eines Proteins ist abhängig von den Eigenschaften des Gels, der angelegten Spannung und der Größe und des isoelektrischen Punkts des Proteins selbst. Sind alle diese Parameter bekannt, kann man bereits grob erkennen, ob und in welcher Stärke bestimmte Proteine oder Proteinfamilien in der Probe enthalten waren. Die Spots werden dann aus dem Gel ausgeschnitten und einem künstlichen Verdau durch Endopeptidasen unterworfen. Diese Enzyme können Peptide, also auch Proteine, an spezifischen Stellen spalten. Das mit Abstand am häufigsten dafür verwendete Enzym ist Trypsin. Es trennt hinter den Aminosäuren Lysin (K) und Arginin (R) auf. Dies ergibt eine für die Massenspektrometrie günstige mittlere Länge. Je nach Protein kann es jedoch erforderlich sein, ein anderes Spaltenzym einzusetzen, etwa wenn die Verdauprodukte für bestimmte Analysemethoden zu lang oder zu kurz sind. Problematisch ist die Tatsache, dass 7

8 Abbildung 2: Gelträger nach Trennvorgang und Färbung das Enzym nicht immer an allen theoretischen Spaltstellen tätig wird. Das kann mehrere Ursachen haben. Entweder reicht die Menge des hinzugegebenen Enzyms nicht aus, das Enzym kann aufgrund der Struktur des Proteins nicht alle Spaltstellen erreichen oder die Werte einiger Umgebungsfaktoren wie die Temperatur oder der ph-wert behindern die Aktivität des Enzyms. Diese ausgelassenen Spaltstellen werden missed cleavages genannt Messung der Peptidmassen Zur eigentlichen Analyse werden die gereinigten Peptide in den Massenspektrometer gegeben und ihre Massen gemessen. Meist werden Geräte vom Typ ESI-TOF oder MALDI-TOF verwendet, also Flugzeitmassenspektrometer. Das Ergebnis ist idealerweise eine exakte Analyse der Peptidmassen in Form einer so genannten Peakliste (siehe Abbildung 1), die üblicherweise die Software des Massenspektrometers selbst aus den Rohmessdaten erstellt. Jedoch gibt es zahlreiche Faktoren, die die Genauigkeit der Ergebnisse stören können und dies in der Praxis auch tun. Abgesehen von einer unsauberen Trennung, die Bestandteile anderer Proteine in der Probe zur Folge hat, sind in ihr häufig auch Verschmutzungen zu finden. Keratine zum Beispiel sind Hauptbestand- 8

9 teil menschlicher Haut und Haare und tauchen regelmäßig in den Ergebnissen mit auf. Oft verwendet man sie daher als Markierung und Nachweis für das korrekte Funktionieren der Apparaturen. Ein weiterer unerwünschter Bestandteil der Messung sind jene Peptide, die durch Autolyse, also der Spaltung der Peptidasen durch sich selbst, entstehen. Darüber hinaus kann es auch zu Fehlern und Messungenauigkeiten durch schlecht kalibrierte Massenspektrometer kommen Datenbanksuche und Bewertung Das Datenbank-Verfahren zur Proteinidentifikation beruht auf der Hypothese, dass sich die Massenspektren der Proteine ausreichend unterscheiden, um sie anhand dessen identifizieren zu können. Spezialisierte Suchprogramme wie MASCOT 1 [PPCC99] vergleichen daher das experimentell gewonnene Spektrum mit den theoretischen Massenspektren von allen Proteinen aus den großen Protein-Datenbanken wie SwissProt 2 [EAC + 03] und PDB 3 [BWF + 00] oder den integrierten Datenbanken des NCBI 4. Dort sind die Eigenschaften aller bekannten Proteine hinterlegt, einschließlich ihrer Aminosäuresequenz. In einem optionalen Schritt werden zuerst die Proteine herausgesucht, deren Masse der Gesamtmasse des untersuchten Proteins entspricht 5. Für jedes dieser Proteine wird der enzymatische Verdau anhand des gewählten Enzyms simuliert. Anschließend kann leicht die Masse jedes entstandenen Peptids berechnet und mit den Messdaten verglichen werden. Dies ist auf den ersten Blick keine schwere Aufgabe, jedoch müssen einige Dinge berücksichtigt werden: Ausgelassene Spaltstellen führen zu einem anderen Peptidzusammensetzung und entsprechend zu einem anderen Massenspektrum. Da man nicht weiß, ob und wo die Enzyme Spaltstellen ausgelassen haben, muss beim simulierten Verdau jede Möglichkeit in Betracht gezogen und für jedes mögliche Peptidzusammensetzung ein neues Massenspektrum berechnet werden. Die Anzahl der Spaltstellen ist ein wichtiger Parameter der Suchprogramme. Als Standardwert nimmt man ein bis zwei mögliche ausgelassene Stellen an. Posttranslationale Modifikationen an Proteinen verändern deren Masse und müssen unter Umständen bei der Berechnung berücksichtigt werden. Suchprogramme wie MASCOT bieten dazu dem Benutzer eine Liste bekannter Standard-Modifikationen zur Auswahl an. Für jede aktivierte Modifikation muss ein neues Massenspektrum berechnet werden National Center for Biotechnology Information der National Institutes of Health in den USA, 5 Normalerweise ist die Gesamtmasse nicht bekannt und alle Einträge müssen durchsucht werden 9

10 Eine Massenspektrometrie ist kein deterministischer Vorgang. Nicht alle Peptide werden ionisiert und nicht alle ionisierten werden auch gemessen. Es gibt häufig Lücken im Spektrum, die der Suche berücksichtigt werden müssen. Die Messtoleranzen der Massenspektrometer sind recht klein, aber sie sind vorhanden und müssen ebenfalls berücksichtigt werden. Übliche Werte liegen im Bereich 0,5 0,8 Dalton (Da), also im Vergleich zur Gesamtmasse eines Proteins im Promillebereich. Auch diese Parameter sind Benutzereingaben. Moleküle haben unterschiedliche Isotopen-Zusammensetzungen, die sich auf die Gesamtmasse des Proteins auswirkt. Die Berechnung der Massen erfolgt jedoch meist anhand der monoisotopischen Masse, also der Masse des am häufigsten auftretenden Isotopen, was meist auch das leichteste ist. Die Kombination aller Toleranzen und Optionen lassen den Suchbereich immer größer werden. Die Suchprogramme müssen allein aufgrund der vielen oben erwähnten Optionen zu jedem Protein in der Datenbank nicht nur ein, sondern eine Vielzahl von Massenspektren berechnen. Darüber hinaus muss wegen der erwähnten Toleranzen die Suche unscharf erfolgen. Das heißt, es werden keine absoluten Werte, sondern ganze Wertebereiche miteinander verglichen, was einerseits den Suchvorgang verlängert, andererseits das Risiko von false positives, also falschen Treffern, erhöht. Die Ergebnisse der Suche werden bewertet. Statt in absoluten Zahlen werden die Ergebnisse meist als Wahrscheinlichkeiten präsentiert. Das ist für menschliche Benutzer besser erfassbar und erhöht die Vergleichbarkeit zwischen verschiedenen Suchalgorithmen. Je mehr Peptide eines Proteins eine zu den Messdaten passende Masse haben, desto höher wird das Protein bewertet. Allerdings spielt auch die Länge der passenden Peptide eine große Rolle, denn je größer diese sind, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass es sich nur um einen zufälligen Treffer handelt. Die meisten modernen Algorithmen verwenden wahrscheinlichkeitsbasierte Bewertungsverfahren [PPCC99, GMK + 04, ZSZ + 06]. 2.3 MS/MS Ionensuche Das Peptide Mass Fingerprinting beruht ausschließlich auf der Massenanalyse einzelner Peptide. Die Masse sagt jedoch nur indirekt etwas über die strukturelle Zusammensetzung der Peptide und somit des Proteins aus. Um eine noch feiner Analyse durchzuführen, misst man nicht mehr nur die Massen der einzelnen Peptide sondern zusätzlich die Massen einzelner Peptidfragmente. 10

11 2.3.1 Tandem-Massenspektrometrie Wie bisher erfolgt die Aufbereitung und der enzymatische Verdau der Probe außerhalb des Spektrometers. Anschließend werden die Peptide mittels High Performance Liquid Chromatography (HPLC) entsalzt, gereinigt und anschließend möglichst einzeln nacheinander in den Massenspektrometer eingebracht. Auch moderne Massenspektrometer können nur wenige Moleküle pro Sekunde verarbeiten und würden bei einer zu großen Anzahl von gleichzeitig eintretenden Peptiden etliche nicht messen können. Die Trennung per HPLC kann dabei nach verschiedenen physikalischen oder chemischen Eigenschaften erfolgen Ziel ist es immer, dass die Peptide aufgrund ihrer unterschiedlichen chemischen Struktur und Größe auch unterschiedliche Zeit benötigen, um durch die verwendeten Trennsäulen zu wandern. Da dieser Zeitwert (retention time) von der Struktur der Peptide abhängt, kann man ihn vorhersagen und neben der Peptidgröße als einen weiteren Faktor bei der Suche passender Peptide verwenden [PKY + 06, SKP + 04]. In der Praxis jedoch werden diese Informationen meist noch nicht genutzt. Die Peptide werden kontinuierlich aus den HPLC-Säulen gelöst und wandern in den Ionisator des Massenspektrometers, üblicherweise ein ESI oder ein MALDI. In der ersten Phase (Selektionsphase) werden die Peptide vermessen, um die wichtige Vorgängerionenmasse zu bestimmen. Danach gelangen sie in die zweite Kammer des Spektrometers, die mit einem Kollisionsgas gefüllt ist (Fragmentationsphase). Dort zerbrechen die Peptide durch die Kollision in mehrere Teile, wobei die Bruchstelle üblicherweise zwischen dem Carbonylkohlenstoff und dem Amidstickstoff der Peptidkette liegt. Diesen Vorgang nennt man collision induced decay (CID). Beim Zerfall entsteht meist ein geladenes und ein nicht geladenes Fragment, allerdings können bei einem doppelt oder dreifach geladenen Vorgängerion auch beide Fragmente ionisiert sein. Nicht geladenen Fragmente können im Massenspektrometer nicht mehr detektiert werden. Die Massen der Nachfolgerionen jedoch werden gemessen und geben in ihrer Gesamtheit Aufschluss über die strukturelle Zusammensetzung des Peptids, da sie sich im Idealfall jeweils nur um den Massenwert einer Aminosäure unterscheiden Suchverfahren Während bei der einfachen Massenspektrometrie eine einzige Peakliste erzeugt wird, so entstehen bei der Tandem-Massenspektrometrie eine ganze Reihe einzelner Spektren, so genannter Compounds. In Abbildung 3 sieht man die grafische Darstellung der relativen Stoffmenge über die Zeit, die die HPLC durch- 11

12 Abbildung 3: MS/MS-Spektrum laufen hat und anschließend im Massenspektrometer analysiert wurde. Jeder einzelne Peak repräsentiert ein oder mehrere detektierte Moleküle, die im Massenspektrometer in ihre Fragmentionen zerfallen sind. Ein Beispiel eines Fragmentionenspektrums ist in dem kleineren Diagramm abgebildet. Anhand dieses Spektrums erfolgt die Datenbanksuche der Tandem-Massenspektrometrie, deren Prinzip der Suche beim Peptide Mass Fingerprinting ähnelt. Sie läuft nach folgendem Schema ab: 1. Verdau des Proteins in silico, also im im Rechner 2. Auswahl der Proteine, deren Peptide die gleiche Masse wie die Vorgängerionen haben 3. Berechnung der theoretischen Fragmentmassen der ausgewählten Peptide und Vergleich mit den Daten des Experiments 4. Bewertung der Peptidtreffer, unter anderem anhand der Anzahl der passenden Fragmentmassen sowie der Wahrscheinlichkeit, dass es sich dabei um einen Zufallstreffer handelt 5. Analoge Bewertung der Proteine unter Berücksichtigung der Anzahl, Größe und Bewertung ihrer Peptide, denen ein Fragmentmassenspektrum zugeordnet werden konnte 12

13 Abbildung 4: Fragmentierungsschema von Peptiden 2.4 De-Novo-Sequenzierung Eine wichtige Voraussetzung und gleichzeitig Einschränkung der beiden oben beschriebenen Verfahren PMF und MS/MS-Ionensuche ist das Vorhandensein einer Proteindatenbank. Die Identifizierung beruht allein auf einem Vergleich mit den Massenspektren bekannter Proteine. Neue, bisher nicht erfasste Proteine können daher nicht identifiziert bzw. sequenziert werden. Bei der De-Novo-Sequenzierung wird hingegen versucht, aus dem Tandem- Massenspektrum eines Proteins direkt seine Aminosäuresequenz zu rekonstruieren. Ein solches Massenspektrum besteht, wie bereits oben beschrieben, aus vielen Fragmentspektren für jede der nach dem Verdau entstandenen Peptidkette eines. Diese Spektren enthalten im Idealfall alle notwendigen Informationen, um daraus die Sequenz der originalen Peptidketten zu berechnen. Die eigentliche Berechnung gleicht einem Puzzlespiel: Ein Peak im Fragmentspektrum repräsentiert ein bei der Kollision entstandenes Fragment. Da die Peptide bevorzugt an ihren Peptidbindungen brechen, unterscheiden sich die Massen der einzelnen Fragmente um die Masse einer oder mehrerer Aminosäuren. Für je zwei benachbarte Peaks wird demnach die passende Aminosäure gesucht, deren Masse etwa der Differenz zwischen den beiden Peaks entspricht. Übersteigt dieser Wert die mögliche Masse einer einzelnen Aminosäure, müssen mehrere Aminosäuren gesucht werden, die in ihrer Summe diese Lücke füllen können. Je nach Situation ist dann die Berechnung allerdings nicht mehr eindeutig in Bezug auf die Aminosäurekombination und deren Reihenfolge im Peptid. Ein wichtiger Bezugspunkt für diese Berechnung ist die Gesamtmasse des Peptids (precursor mass), insbesondere bei lückenhaften Fragmentspektren. Der Bruch 13

14 Abbildung 5: MS/MS-Fragmentspektrum mit passenden Aminosäuren in den Peptidbindungen kann an verschiedenen Stellen stattfinden, was zu letztendlich zu unterschiedlichen möglichen Fragmentmassen führt. Wichtig ist auch, welches der beiden Bruchstücke nach dem Bruch der Ladungsträger ist. Bei einfach geladenen Ionen kann nur ein Fragment im Massenspektrometer registriert werden, denn das andere trägt keinen Ladungsüberschuss und ist damit kein Ion mehr. Welches Fragment geladen ist und an welcher Stelle die Fragmentierung bevorzugt stattfindet, ist Eigenschaft des Peptids und hängt von der Zusammensetzung und der Reihenfolge seiner Aminosäuren ab [Lot98, Seite 344]. Die einzelnen Fragmente werden heutzutage nach der Nomenklatur von Roepstorff und Fohlmann benannt. Demnach werden sie nach Leserichtung bzw. Terminus und genauer Bruchstelle unterschieden. N-terminale Bruchstücke heißen a-, b- oder c-ionen, C-terminale entsprechend x-, y- oder z-ionen. Abbildung 4 verdeutlicht dieses Schema. Gelingt es, eine komplette Ionenserie (ion ladder) im Spektrum zu identifizieren, ist die Rekonstruktion der Ausgangssequenz des Peptids eine leichte Aufgabe. Die am häufigsten auftretenden Ionen sind die der b- und y-serien. In Abbildung 5 sind die Peaks der y- und b-ionen-serie als solche gekennzeichnet. Unter der Voraussetzung, dass die gemessenen Fragmente einfach geladen 14

15 waren, kann man die Werte direkt als Masse interpretieren. Die Differenz der beiden ersten Fragmentmassen y1 und y2 beträgt etwa 113 Da. Nach der Zuordnung der Peaks zu einer Ionenserie muss nun eine Aminosäure gefunden werden, die eine passende Masse besitzt, um diese Differenz auszugleichen. Die Aminosäuren Leucin und Isoleucin haben beide eine Masse von 113,16 Da, passen also genau in die Lücke. Analog erfolgt die Suche für alle anderen Peaks bzw. Lücken und erlaubt auf diesem Weg die Berechnung des gesamten Peptids Postprocessing Der Vorteil der De-Novo-Sequenzierung liegt in seiner Unabhängigkeit von Datenbanken. Jedoch kommt dieses Verfahren schnell an seine Grenzen, wenn, wie in der Praxis häufig anzutreffen, die Ionenserien nicht vollständig oder nicht eindeutig im Spektrum identifiziert werden können. Oft gibt es mehrere passende Kombinationen von Aminosäuren. Die De-Novo-Algorithmen geben dann eine Liste mit den wahrscheinlichsten Ergebnissen aus, die sich häufig nur an einer Stelle unterscheiden, wie im Beispiel im Anhang C zu sehen ist. Um diese Ergebnisse einem Protein zuordnen zu können, prüft man zum Beispiel die berechneten Peptidketten mit Hilfe von BLAST [AL90] gegen eine Proteindatenbank. BLAST sucht dabei nach solchen Proteinen, deren Aminosäuresequenz einen Abschnitt enthält, der gleich oder ähnlich ist zu der Sequenz, die der De- Novo-Algorithmus aus dem Massenspektrum errechnet hat (local alignment). Die Ähnlichkeit wird dabei als Summe aller für einen Abgleich notwendigen Veränderungen an der Sequenz quantifiziert. Veränderungen können Einfügungen, Auslassungen und Vertauschung von Aminosäuren sein. Die Strafpunkte für Austausche sind zum Beispiel in standardisierten Ersetzungsmatrizen wie PAM30 definiert. 2.5 Vergleich der Verfahren Sowohl das Datenbank- als auch das De-Novo-Verfahren hängen von Massenspektren mit hoher Qualität ab. Unsaubere Proben oder eine ungenaue Messung können die Genauigkeit beider Verfahren erheblich schmälern. Ein bereits angesprochener Nachteil des Verfahrens der Ionensuche anhand von MS/MS-Spektren ist seine Abhängigkeit von einer Datenbank. Wenn in dieser kein Protein bzw. Peptid mit einem passenden Massenspektrum gefunden wird, so gilt die Probe als nicht identifizierbar. Wird andererseits jedoch ein Treffer gefunden und hoch bewertet, so kann man normalerweise auch von einem korrekten Ergebnis ausgehen. Die Ergebnisse der De-Novo-Sequenzierung sind hingegen nicht direkt verifizierbar. Sie müssen in einem weiteren Schritt zum 15

16 Beispiel per BLAST-Suche überprüft werden. In vielen Situationen wäre eine Kombination der beiden Verfahren ideal. Zuerst wird per schneller Ionensuche nach einem passenden bekannten Protein in den Datenbanken gesucht. Sollte dies nicht zum Erfolg führen, also nur gering bewertete oder gar keine Ergebnisse liefern, kann die Analyse per De-Novo-Sequenzierung weitergeführt werden. Sind deren Ergebnisse hoch bewertet, ist sich also der Algorithmus sehr sicher, so kann es sich möglicherweise um ein neues, bisher nicht dokumentiertes Protein handeln. 3 Web-Schnittstelle für SEQUIT SEQUIT 1 [DW04] ist ein kommerzielles Programm zur De-Novo- Sequenzierung von Proteinen. Ursprünglich an der Berliner Charité entstanden, wird es heutzutage durch die Firma Proteome Factory AG in Berlin weiterentwickelt und vertrieben. Es verarbeitet Massenspektren von MALDI- und ESI-Tandem-Massenspektrometern und berechnet wie oben beschrieben aus Fragmentspektren die strukturelle Zusammensetzung von Peptiden. Nach der Berechnung der Aminosäuresequenz der einzelnen Peptidketten werden diese per BLAST-Suche gegen eine Proteindatenbank geprüft. Damit können mehrere Sachverhalte überprüft werden, z.b. welche der berechneten Peptidketten in bekannten Proteinen vorkommen und welche nicht. Oft lässt sich über diesen Weg das gesamte Protein identifizieren, nämlich dann, wenn besonders viele der von SEQUIT berechneten Peptide gegen ein bestimmtes Protein matchen. Das eigentliche Programm besteht aus zwei Komponenten, einem Shell- Programm für die eigentlichen Berechnungen und einer separaten graphische Benutzeroberfläche, mit deren Hilfe sich Spektren laden, Programmoptionen einstellen und Ergebnisse ansehen lassen. Beide Programme sind mit Microsoft Visual Studio in C++ entwickelt worden und nur auf Microsoft Windows ausführbar. Während die De-Novo-Algorithmen bereits gut funktionieren, wird an der graphischen Oberfläche weiter gearbeitet, denn das Programm soll als kommerzielles Produkt auch besonders gut zu bedienen sein. De-Novo-Sequenzierung in kommerziellen Produkten ist noch relativ neu und muss sich wie die meisten Produkte im Bereich Protein-Seqenzierung bezüglich ihrer Leistungen an den traditionellen Programmen wie MASCOT messen lassen. Üblich ist es, dass sich diese Produkte online über eine Web-Schnittstelle ausführlich und fast ohne Einschränkungen testen lassen. Einzig die Anzahl der Fragmentspektren, die z.b. MASCOT in einem Auftrag akzeptiert, sind bei Nutzung der öffentlichen Version limitiert. Natürlich liegt genau hier das Problem 1 und 16

17 bei professioneller Nutzung und der Anreiz zum Kauf. Eine Web-Schnittstelle zum Testen der professionellen Biotechnologie-Software ist heutzutage also obligatorisch. Eine Aufgabe im Rahmen dieser Arbeit war die Neuentwicklung der Web- Schnittstelle für SEQUIT. Die Online-Version einer Software zu präsentieren, kann für die jeweilige Firma auch einige wichtige Sekundäreffekte haben. Zum einen wird die Webseite innerhalb der potenziellen Nutzergruppe weiterempfohlen, zum anderen wird sie in die zahlreichen entsprechenden Webseiten und Software-Listen aufgenommen, der Name des Produktes und der Name der Herstellerfirma werden so positiv besetzt und verbreitet. Das ist für die Proteome Factory AG ein nicht zu unterschätzender Mehrwert, da ihre Dienstleistungen auch international nachgefragt werden. 3.1 Ist- und Bedarfsanylse Die Proteome Factory AG besaß bereits eine Online-Version ihrer Software, die ausgebaut und erweitert werden konnte. Die Webseite lief auf einem Apache- Webserver mit installiertem Perl unter Windows Es existierte ein Formular zur Eingabe der notwendigen Daten und zum Starten des Programms sowie eine Ausgabe der Ergebnisse als einfachen Text auf der Webseite. Aus Benutzersicht ist das größte Manko die statische Präsentation der Berechnungsergebnisse, die weder eine Sortierung noch eine einfache Weitergabe erlaubte. Für letzteres musste der komplette Text der Ergebnisseite kopiert und per verschickt werden - meist einhergehend mit einem Verlust der starren Formatierung. Darüber hinaus konnte das Browser-Fenster während der Berechnung nicht geschlossen werden, da ansonsten später kein Zugriff auf die Ergebnisse mehr möglich war besonders bei länger dauernden Berechnungen ein störender Umstand. Die Aufgaben an die neue Web-Schnittstelle ließen sich daher klar formulieren. Es soll dem Benutzer die Möglichkeit geben, SEQUIT mit einigen Einschränkungen, jedoch zeitlich unbegrenzt zu testen, um ihn so von der Güte des Produktes zu überzeugen und zum Kauf anzuregen. Die Bedienung muss intuitiv sein und sich idealerweise an bekannten Schnittstellen wie der von MASCOT orientieren, um einen Wiedererkennungseffekt zu erzielen. Man darf davon ausgehen, dass der Benutzer mit grundlegenden Begriffen der Biotechnologie, insbesondere der Proteinidentifikation vertraut ist. Nachfolgend sind die wichtigen Anforderungen zusammengefasst: 17

18 Web-Formular Klare Gliederung mit bekannter Struktur Keine Registrierung notwendig -Benachrichtigung bei Berechnungsende (kein Wartezwang) Einfacher späterer Zugriff auf vorherige Berechnungen (Jobs) Präsentation der Ergebisse Übersicht über alle vorherigen Jobs Klar gegliederte Darstellung der SEQUIT- und BLAST-Ergebnisse Sortierung der Ergebnisse möglich Direkte Verlinkung aus den Ergebnissen zu SwissProt Erweiterungsmöglichkeiten Ausbau zum Laborsystem mit zentralem Server ermöglichen Spätere Wiederholung der BLAST-Suche (Versionierung) 3.2 Struktur von SEQUIT Online Abbildung 6 verdeutlicht die Struktur und den Ablauf von SEQUIT Online. Im folgenden werden die Module und ihre Funktion im einzelnen beschrieben Web-Formular Mit Hilfe des Web-Formulars (siehe Anhang B) kann der Benutzer sowohl neue Aufträge (Jobs) starten, als auch auch seine früher abgegebenen Jobs zugreifen. Dazu wurde das Formular in zwei Teile geteilt. Im oberen Teil gibt der Benutzer seine -Adresse ein und vergibt einen beliebigen Namen für seinen Job. Die -Adresse wird später zur Identifizierung und Zuordnung der Jobs verwendet. Dann wählt er eine Datei von seiner lokalen Festplatte aus, die die Fragmentspektren enthält und kann einige Parameter 1 für SEQUIT und einen für BLAST festlegen: 1 Da die Onlineversion von SEQUIT kein vollwertiger Ersatz für das komplette Programm sein soll, sind einige Auswahlmöglichkeiten limitiert. Beispielsweise kann als Enzym nur Trypsin ausgewählt werden. Auch die Auswahl der Organismen für die BLAST-Suche ist beschränkt. 18

19 HTML- Formuar Spektrum Perl/CGI URL senden Aufruf BLAST SEQUIT MySQL Perl Parser Ergebnis PHP Ergebnis-Präsentation Abbildung 6: Struktur von SEQUIT-Online Die Massentoleranzen für die Vorgänger- und Nachfolger-Ionen Typ des verwendeten Massenspektrometers Berechnungsqualität. Dies beeinflusst die maximale Anzahl der Aminosäuren für das Füllen von Lücken unvollständiger Fragmentionenserien Enzym, das für den Probenverdau verwendet wurde Organismus, auf den sich die BLAST-Suche beschränken soll Im unteren Teil des Formulars kann der Benutzer durch Angabe seiner - Adresse auf früher abgegebene Jobs zugreifen. 19

20 3.2.2 CGI-Skript Das Abschicken des Formulares bewirkt den Aufruf eines Perl-Skriptes Calc.pl, welches über das Common Gateway Interface (CGI) des Webservers aufgerufen wird. Das Skript verwendet ein selbstgeschriebenes Perl-Modul Seqparse.pm, welches Funktionen für das Parsen der SEQUIT-Ausgabedateien und die Kommunikation mit dem Datenbank-Server bereit hält. Für letzeres wird das Standard-Perl-Modul DBI genutzt. Zum korrekten Funktionieren der Skripte muß dieses Modul daher in der lokalen Perl-Installation aktiviert sein. Calc.pl führt zuerst eine Überprüfung der übergebenen Parameter durch, setzt dann die Befehle zum Aufruf von SEQUIT und BLAST zusammen und startet nach erfolgreichem Durchlauf dieser beiden Programme den Parse-Prozess Parser Der Parser dient dazu, aus den einzelnen Ergebnis-Dateien, die SEQUIT und BLAST als Textdateien anlegen, alle notwendigen Daten zu extrahieren und in der Datenbank abzuspeichern. SEQUIT legt für jede Eingabedatei ein Arbeitsverzeichnis an. Ein typisches Verzeichnis ist in Abbildung 7 dargestellt. Die Datei Analysis_0004_2+.mgf enthält das hochgeladene Fragmentspektrum. SEQUIT hat ein zugehöriges Verzeichnis Analysis_0004_2+.mgf-res angelegt, in der alle Ausgabedateien gespeichert werden. Die Datei peptides.txt enthält alle von SEQUIT berechneten Peptid-Kandidaten für das gegebene Massenspektrum. Ein Beispiel ist im Anhang C abgebildet. Eine Schlüsselfunktion besitzt die Datei blastres.txt, denn es kommt vor, dass SEQUIT aufgrund schlechter Datenqualität nicht in der Lage ist, aus dem vorgelegten Massenspektrum ein Peptid zu berechnen. Damit hat BLAST keine Arbeitsgrundlage, wird nicht aufgerufen und erzeugt entsprechenden auch keine Ausgabedateien. Die Existenz dieser Datei ist der Hinweis darauf, dass SEQUIT Daten erolgreich berechnen konnte. Fehlt sie, wird die gesamte Verarbeitung an dieser Stelle abgebrochen und keine Daten gespeichert. Ist die Datei blastres.txt jedoch vorhanden, dann hat SEQUIT erfolgreich Peptide berechnen können und es befinden sich in dieser Datei die Treffer, die BLAST durch seine Alignment-Suche hat finden können. Das Modul Seqparse.pm verwendet Perls mächtige Reguläre Ausrücke, um sowohl die einzelnen berechneten Peptide als auch eventuelle BLAST-Treffer aus den Textdateien zu extrahieren und in der MySQL-Datenbank zu speichern. 20

21 Abbildung 7: Struktur der SEQUIT-Ausgabe Datenbank Die Aufgabe der Speicherung aller Ergebnisse wurde dem Datenbank- Managementsystem MySQL übertragen, da sich sowohl seine Installation, Bedienung und Wartung als auch seine Anbindung an Perl und PHP einfach und schnell gestaltet. Aufgabe des Datenbanksystems ist die Speicherung der Ergebnisse der De-Novo-Sequenzierung durch SEQUIT und der anschließenden Proteinsuche durch BLAST. Der Benutzer soll zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt seine Ergebnisse abrufen können. Gleichzeitig muss der Proteome Factory AG als Betreiber der Webseite eine größtmögliche Kontrolle über den Umfang der Daten gegeben werden. Die Verwendung eines Datenbanksystems vereinfacht unter anderem die planmäßige automatische Löschung alter Ergebnisse. Beim Entwurf der Datenbankstruktur wurde darauf geachtet, das System in Zukunft leicht erweitern zu können. Die Datenbankstruktur hält sich in einigen Aspekten absichtlich nicht an die limitierenden Einschränkungen des HTML- Formulars. Dieses erlaubt beispielsweise nur das Berechnen eines einzelnen Fragmentionen-Spektrums gleichzeitig, während in der Datenbank die Zahl der Fragmentspektren pro Job nicht begrenzt ist. Dies greift bereits einer möglichen späteren Verwendung als Teil eines separaten Softwarepaketes vorweg. Darauf zielt auch eine weitere wichtige Eigenschaft der Datenbankstruktur ab, nämlich die Unterstützung einer einfachen Versionierung der BLAST-Ergebnisse. Denn manchmal stockt der De-Novo-Identifikationsprozess dann, wenn SE- QUIT Peptide mit einem hohen Score berechnet hat, die jedoch anschließend nicht per BLAST-Suche gefunden werden können oder nur sehr schlecht bewertet werden. Dann kann es interessant sein, nach einem zukünftigen Update der von BLAST verwendeten Datenbank eine erneute Suche zu starten und möglicherweise bessere Ergebnisse zu erhalten. Abbildung 8 zeigt die Struktur 21

22 Jobs id hash title client timestamp Spectra id id_job file Blastversion id_blastversion version db matrix Denovoseq id id_spectrum score all_match tf_match coverage sequence Blastresults id_denovoseq id_blastversion prot_id accession score evalue blastquery queryseq queryseq_start queryseq_stop hitseq hitseq_start hitseq_stop modseq identities positives Denovorun id_spectrum sample molmass pm_tolerance fm_tolerance Abbildung 8: Datenbank-Schema von SEQUIT Online der Datenbank, deren einzelnen Tabellen im folgenden genauer beschrieben werden. Jobs In dieser Tabelle werden die einzelnen Jobs verwaltet. Sie enthält eine eindeutige fortlaufende Identifikationsnummer (id), den Jobnamen (title), die eingegebene -Adresse des Benutzers (client) sowie den Zeitpunkt des Jobeingangs (timestamp) und eine per Hashfunktion erzeugte individuelle und eindeutige Zeichenkette, die für den Zugriff auf die Jobs über das Web-Formular verwendet wird. Dies ist im Gegensatz zu einer fortlaufenden Nummer ein einfacher Mechanismus, der den Zugriff auf fremde Jobs durch einfaches Ändern der laufenden Nummer im URL verhindert. 22

23 Spectra Hier werden die zu einem Job gehörenden Spektren gespeichert. Jedes Spektrum erhält eine Nummer (id) und einen Verweis auf den zugehörigen Job (id_job). Außerdem wird der Pfad der Datendatei gespeichert (file), die das Spektrum enthält. Alternativ könnte man auch das Spektrum direkt speichern. Denovorun Diese Tabelle enthält zu jedem Spektrum den Namen des Compounds (sample), die Masse des Vorgängerions (molmass) sowie die vom Benutzer als Parameter in der Web-Schnittstelle eingegebenen Toleranzen für die Peptidund die Fragmentmassen (pm_tolerance und fm_tolerance). Denovoseq An dieser Stelle werden alle von SEQUIT aus dem Massenspektrum berechneten Aminosäuresequenzen (sequence) und ihre Bewertungen (score) abgelegt. Standardmäßig berechnet SEQUIT 20 Kandidaten, die nach ihrer Bewertung sortiert ausgegeben werden. Blastresults Die Ergebnisse der BLAST-Suche werden in dieser Tabelle gespeichert. Dazu gehören die Verweise auf die Ausgangssequenz (id_denovoseq) und die verwendete BLAST-Version (id_blastversion). Zu jedem Treffer werden die aus den Proteindatenbanken stammende Protein-ID (prot_id) und die zum Direktzugriff nötige accession number (accession) gespeichert. Ferner sind die BLAST-Bewertungen (core und evalue), die tatsächliche Suchsequenz mit ihrer relativen Position in der SEQUIT-Sequenz (queryseq,... ), die Treffersequenz samt Position in der Gesamtproteinsequenz (hitseq,... ) und die für ein Abgleich notwendigen Veränderungen an der Suchsequenz gespeichert (modseq). Die Felder identities und positives geben Auskunft über die Anzahl der in Suchund Treffersequenz identischen bzw. funktional gleichen Aminosäuren. Blastversion In dieser Tabelle werden die verschiedenen BLAST-Versionen dokumentiert (version), samt verwendeter Datenbank (db) und Ersetzungsmatrix (matrix) Ergebnispräsentation Die Darstellung der Ergebnisse, also das Abfragen der Datenbank, Formatierung, Verlinkung und Sortieren übernimmt ein PHP-Skript, welches über einen eigenen URL erreichbar ist. Der in der Datenbank abgelegte Hashwert dient zur Identifizierung einzelner Jobs und wird dem Skript per Parameter id im URL übergeben 1. Anhand diesem fragt das Skript alle notwendigen Daten aus 1 Beispielsweise als 23

24 der Datenbank ab und stellt sie grafisch aufbereitet auf der Webseite dar. Die Sprache der Webseite ist momentan Englisch, eine Lokalisierung kann bei Bedarf einfach implementiert werden. Die Seite ist in fünf Abschnitte unterteilt. Im Anhang D ist ein Bildschirmfoto der Webseite zu sehen. Job Details Enthält den Jobnamen, einen Link zur Übersicht über alle Jobs des Benutzers, die -Adresse und das Auftragsdatum. Spectrum Details Neben dem Sample- bzw. Compound-Namen werden die Masse des Vorgängerions sowie die beiden eingestellten Toleranzen dargestellt. Calculated Sequences In einer Tabelle werden alle durch SEQUIT berechneten Peptide inklusive ihrer Bewertung sowie die jeweiligen besten BLAST- Ergebniswerte aufgeführt. Die Tabelle lässt sich nach allen Spaltenwerten sortieren. Die insgesamt am höchsten bewertete Sequenz ist zur schnellen optischen Erfassung mit einer grünen Umrandung versehen. Sequenzen, die BLAST erfolgreich gegen ein Protein matchen konnte, sind direkt mit mit den entsprechenden BLAST-Ergebnissen weiter unten auf der Seite verlinkt. BLAST Results Dieser Abschnitt enthält zu jeder Sequenz, die BLAST erfolgreich gegen ein oder mehrere Proteine aus der Datenbank hat matchen können, eine Tabelle mit den genauen Ergebnissen. Es werden für jedes einzelne Protein der Name und die Identifikationsnummer im FASTA-Format angezeigt, gefolgt von den detaillierten Angaben des BLAST-Algorithmus bezüglich e-value, Score, Identities, Positives und den Alignment Details. BLAST Info Am Ende der Seite wird die verwendete BLAST-Version, die Datenbank und die verwendete Ersetzungsmatrix aufgeführt. Wie oben bereits angesprochen, gibt es eine zweite Seite, die dem Benutzer alle seine in der Datenbank vorhandenen Jobs anzeigt. Die Identifikation erfolgt in diesem Fall über seine -Adresse, die ebenfalls per Parameter im URL übermittelt wird 1. Die URLs werden nach der Berechnung durch das Perl- CGI-Skript per an den Benutzer versendet und auch auf der Webseite angezeigt

25 3.3 Weiterentwicklung Zur Zeit ist SEQUIT eine Windows-basierte Einzelplatz-Software, die sich eher für kleine Labore eignet. Um unerlaubter Vervielfältigung vorzubeugen, ist die Programmausführung an einen USB-Dongle gekoppelt, ohne den das Programm nicht arbeitet. In größere Laboren mit mehreren Arbeitsstationen ist dieses System aus verschiedenen Gründen nicht mehr sinnvoll. Es müssten entweder mehr Lizenzen gekauft werden als eigentlich notwendig oder die Mitarbeiter müssen ihre Dongle von einer Arbeitsstation zur anderen mitnehmen, falls sie SEQUIT dort einsetzen möchten. Weiterhin ist es in der Zeit vernetzter Systeme nicht sinnvoll, Ergebnisse nur als Textdatei auf dem lokalen Rechner zu speichern. Auch eine zentrale Speicherung auf einem Dateiserver ist keine praktische Lösung. Die Textdateien müssten in einer auf Dateisystemebene angelegten Struktur in den richtigen Ordner kopiert werden, können dort versehentlich gelöscht werden und sind nicht so schnell zugänglich wie beispielsweise über eine Webseite. Für solche Fälle ist eine Client-Server-Struktur die bessere Lösung. Möchte man SEQUIT selber nicht zu einem solchen System umprogrammieren, könnte man es auf einem Host im lokalen Netzwerk zusammen mit einem Webserver, Perl und PHP installieren, was mit Hilfe entsprechender Pakete 1 auch unter Windows problemlos und vor allem schnell machbar ist. Dann kann das vorgestellte SEQUIT Online Paket, bestehend aus Perl-Parser, MySQL-Datenbank und PHP-Skripten, installiert werden. In Abwandlung an die vorgestellte Version müssten jedoch einige Anpassungen vorgenommen werden: 1. Das Webformular muss mehrere Dateien zum Hochladen akzeptieren und das Perl-CGI-Skript mehrere Compounds in einer Datei zulassen, um alle Fragmentspektren eines Analysedurchgangs (Scan) abspeichern zu können. Pro Scan werden leicht einige tausend Fragmenspektren produziert. 2. Die Beschränkungen bezüglich der Auswahl des Enzyms und der Organismen des Webformulars müssen aufgehoben und möglicherweise mehr Möglichkeiten zur Steuerung der beiden Programme SEQUIT und BLAST hinzugefügt werden. 3. Die Versionierung wird zwar bereits vom Datenbankschema unterstützt, allerdings existiert moch kein regelmäßig und automatisch ausgeführtes Skript, welches die installierten Versionen von BLAST und der Datenbank überprüft und bei einer Veränderung alle gering oder gar nicht durch BLAST bewerteten Peptidsequenzen erneut einer BLAST-Suche 1 Beispielsweise XAMPP von 25

26 unterzieht. Idealerweise gäbe es zur Steuerung dieses Automatismus eine Administrationsoberfläche. 4. Die grafische Darstellung der Berechnungsergebnisse von SEQUIT muss verbessert werden. Dazu gehört vor allem die Berechnung der theoretischen Fragmentmassen. SEQUIT müsste dafür jene Daten aber auch ausgeben. 5. Zur Zeit kann SEQUIT nur einfache Peaklisten im bekannten zweispaltigen Format <m/q-wert Intensität> einlesen. Eine zu hohe Komplexität der Massenspektren überfordern den De-Novo-Algorithmus. Notwendig ist eine manuelle oder sogar automatische Entscheidung, ob die gelieferten Daten bereits prozessiert wurden, oder ob es sich um so genannte Rohdaten handelt. In diesem Fall muss ein Peak Picker eingesetzt werden, also ein Algorithmus, der unter anderem aus den Rohdaten des Massenspektrometers das Rauschen entfernt (denoise), einzelne Peaks zusammenfasst und anschließend die Daten in einem SEQUIT-kompatiblen Format ausgibt. 3.4 Peak-Picking-Algorithmus Entsprechende Versuche des Autors, den Peak Picker der OpenMS-Bibliothek 1 für diesen Zweck einzusetzen, sind gescheitert. Da der Peak Picker jedoch ein wichtiger Bestandteil von SEQUIT Online werden sollte, wurde letztendlich ein Algorithmus selbst in Perl implementiert. Dieser beruht auf der in [GMK + 04] vorgestellten Idee. Der umgesetzte Peak-Picking-Algorithmus verhält sich wie folgt: 1. Einlesen der Rohdatei (Fragmenspektrum), dabei Peptidmasse und Ladung auslesen. Die Ionenmassen und die zugehörigen Intensitäten werden in ein Array gelesen. 2. Anwendung eines Hochpass-Filters. Peaks mit weniger als 2,5% der Intensität des intensivsten Peaks werden entfernt. 3. Entfernung nicht-monoisotopischer Peaks. Ausgehend vom intensivsten hin zum schwächsten, werden alle Peaks, die sich in einer Umgebung von 0 bis +2 Da vom aktuellen befinden, entfernt. 4. Entfernung aller zu nahen Nachbarpeaks. Wieder ausgehend vom intensivsten werden alle Peaks in der Umgebung von 27 Da entfernt, es sei denn die Differenz beträgt genau 1 Da, 17 Da oder 18 Da. 27 Da ist

27 weniger als die Masse eines Aminosäurerestes, so dass sich von der gleichen Ionenserie keine weiteren Peaks in der Nähe befinden können. Die Ausnahmen beziehen sich auf Gewichtsverluste durch Wasser- oder Ammoniakabspaltung bzw. auf den monoisotopischen Peak, sofern es ihn gibt. Eingabeformate sind sowohl Dateien im Mascot Generic Format (MGF) als auch normale DTA-Dateien, deren Kopfdaten nicht gesondert gekennzeichnet sind, sondern nur die Peptidmasse in der ersten Zeile steht. Ausgabeformat ist MGF. In mehreren Tests mit Testdaten, die SEQUIT im normalen Zustand sehr lange rechnen lassen und bei SEQUIT Online eine Fehlermeldung wegen zu langer Laufzeit auslösen konnten gute bis sehr gute Ergebnisse erzielt werden. SE- QUIT war in der Lage, mit den modifizierten Daten einige sehr hoch bewertete Sequenzen zu berechnen, die auch bei der anschließenden BLAST-Suche hohe Treffer erzielten. Der Peak Picking-Algorithmus ist also ein erster Schritt im Ausbau von SEQUIT Online zu einem universal einsetzbaren System. 27

28 A Tabelle: Alle Aminosäuren und ihre Massen Aminosäure 3-Buchstabencode 1-Buchstabencode Masse in u (Durchschnitt) Alanin ALA A Arginin ARG R Asparagin ASN N Aspaginsäure ASP D Cystein CYS C Glutamin GLN Q Glutaminsäure GLU E Glycin GLY G Histidin HIS H Isoleucin ILE I Leucin LEU L Lysin LYS K Methionin MET M Phenylalanin PHE F Prolin PRO P Serin SER S Threonin THR T Tryptophan TRP W Tyrosin TYR Y Valin VAL V

29 B Webformular von SEQUIT Online 29