Nachweis allergener Haselnussbestandteile in Backwaren und in den dafür verwendeten Rohstoffen und Zwischenprodukten. 57. Tagung für Getreidechemie

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1 Nachweis allergener Haselnussbestandteile in Backwaren und in den dafür verwendeten Rohstoffen und Zwischenprodukten 57. Tagung für Getreidechemie Detmold, 21. Juni 2006

2 Allergenkennzeichnung Allergene Zutaten nach Anlage 3 LMKV sind bei fertig verpackten Backwaren mit einem deutlichen Hinweis auf das zugrundeliegende Allergen anzugeben. Wo? Innerhalb der Zutatenliste! In welchen Fällen? Immer! Selbst bei geringsten Mengen!

3 Kreuzkontaminationen Allergene Bestandteile, die unbeabsichtigt oder zufällig über Rohstoffe oder technologische Prozesse in Backwaren gelangen können, sind keine Zutaten im Sinne der LMKV. Sie müssen daher in der Zutatenliste nicht angegeben werden. Was ist aber mit produkthaftungsrechtlichen Instruktionspflichten (Warnhinweisen)?

4 Kreuzkontaminationen in der Praxis

5 Wie kommen Kreuzkontaminationen zustande? Beim Anbau auf dem Acker (Durchwuchs, benachbarte Felder) Bei Ernte, Transport, Lagerung Auf technischen Anlagen (z.b. bei Produktwechsel in Förder- und Misch- und Abfülleinrichtungen sowie Produktionsanlagen, Sieden in Fett etc.) Durch Stäube

6 Untersuchungsergebnisse der amtlichen Lebensmittelüberwachung (CVUA Freiburg)

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8 Zitate aus dem Schreiben des Justiz- Ministeriums an den Gewürz-Verband Ob ein Lebensmittelhersteller wegen Nicht- Kennzeichnung von Spuren zum Schadenersatz verpflichtet ist, haben im einzelnen Schadensfall die Gerichte zu entscheiden. Die nunmehr umfassende Kennzeichnungspflicht von allergenen Zutaten könnte bei den Produktadressaten die evt. berechtigte Erwartung wecken, dass kennzeichnungspflichtige Stoffe erst recht nicht als unbeabsichtigte Spuren ohne Kennzeichnung enthalten sind. Ob solche Erwartungen berechtigterweise bestehen, obliegt allerdings der Klärung durch die Gerichte.

9 Grenzwerte In der EU gibt es noch keine Grenzwerte für allergene Bestandteile in Lebensmitteln. Allergologen: 1 mg allergenes Protein /kg Lebensmittel = 1 ppm In der Schweiz gibt es für unbeabsichtigte Vermischungen einen Grenzwert von 1 g allergener Bestandteil /kg Lebensmittel (1000 ppm) : > 1 g/kg: Muss-Hinweis < 1 g/kg: Kann-Hinweis In Diskussion in BRD: ppm des allergenen Lebensmittels oder 1 10 ppm des entsprechenden Proteins.

10 Ausgangsituation und Problemstellung Wie zuverlässig sind die derzeitigen analytischen Methoden zur Untersuchung von Haselnuss-Spuren in komplexen und hochverarbeiteten Lebensmitteln wie Backwaren, Backmitteln und Backmischungen? Können mit diesen Methoden Prozesskontrollen zur Erfassung von Cross Contacts durchgeführt werden? Sind die Methoden geeignet, die Einhaltung von diskutierten Grenzwerten zu überprüfen?

11 Anforderungen an die Nachweisverfahren Ausreichende Spezifität Ausreichende Zuverlässigkeit Anwendbar für möglichst viele Lebensmittelmatrizes Ausreichende Empfindlichkeit: Forderung der DGAI*: 1 mg Protein /kg Lebensmittel = 1 ppm = 0,0001% * Arbeitsgruppe Nahrungsmittelallergie der Deutschen Gesellschaft für Allergologie und Immunologie

12 Analysenmethoden zum Allergennachweis Speziesnachweis auf Proteinebene durch immunologische Methoden (ELISA) Nachweisgrenze : 0,1 1mg Protein/kg bzw mg allergenes Lebensmittel/kg in gewissen Bereichen quantifizierbar Speziesnachweis auf DNA-Ebene (PCR) Nachweisgrenze: 5-50 mg allergenes Lebensmittel/kg Qualitative Methode Quantifizierung in Zukunft möglich?

13 Untersuchungsansatz Analysenmethoden ELISA-Testkit RIDASCREEN FAST Hazelnut Sandwich-Enzymimmunoassay(r-biopharm) Nachweisgrenze: 1,5 mg Haselnuss /kg Bestimmungsgrenze: 10 mg Haselnuss /kg Quantifizierungsbereich: mg Haselnuss/kg Qualitative PCR mit spezifischen Primern für die Sequenz des Haselnussproteins Cor a (45 Zyklen) Nachweisgrenze: 20 mg Haselnuss /kg

14 Untersuchungsansatz Untersuchte Produkte/Stufenkontrolle Rohstoffe (Lebensmittel inkl. Zusatzstoffe) (n=57) Backgrundstoffe (Backmittel, Backmischungen) ohne und mit definierter Haselnuss-Dotierung (n=6) Teige und Massen ohne und mit definierter Haselnussdotierung (n=11) Backwaren ohne und mit definierter Haselnuss- Dotierung (n=11)

15 Untersuchungsansatz Untersuchte Produkte/Haselnüsse Haselnüsse einer Charge mit unterschiedlichen Röstgraden: Rohe Haselnüsse Geröstete Haselnüsse (5 Min) Geröstete Haselnüsse (10 Min) Geröstete Haselnüsse (15 Min) Geröstete Haselnüsse (20 Min) Geröstete Haselnüsse (24 Min) Gehackte, geröstete Haselnüsse zur Dotierung

16 Ergebnisse ELISA Proben ohne Haselnüsse Proben mit Haselnuss negative Proben falschpositive Proben Dotierte Proben Haselnüsse Rohstoffe Rohstoffe Rohstoffe Rohe Nüsse Rohe Nüsse Zwischenprodukte Zwischenprodukte Zwischenprodukte Geröstete Nüsse Backwaren Backwaren Backwaren

17 Kalibrierkurve ELISA 2,50 Extinktion 2,00 1,50 1,00 20 ppm 15 ppm 14 ppm 0,50 0,00 0,001 0,01 0,1 log Conc gemessene Standards (0 ppm, 2,5 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm) gemessene Proben in ppm berechneter Sollgehalt der Proben in ppm

18 Auswertung der Standards aus 30 Messungen 30 Haselnussgehalt in mg/kg ,001 3,6 4 2,3 0 ppm 2,5 ppm 5 ppm 10 ppm 20 ppm Sollgehalt der Standards

19 Proben ohne Haselnüsse Rohstoffe: negative Proben Getreideerzeugnisse (n=5) Zucker (n=2) Salz Hefe Kirschen Mohn Erdnüsse Makadamianüsse Pinienkerne Ascorbinsäure modifizierte Stärke Verdickungsmittel Milchprodukte (n=5) Fette inkl. Butter (n=3) Aromen (n=4) Eier Sonnenblumenkerne Kürbiskerne Sesam Lupinenmehl Emulgatoren (n=4) Citronensäure Backtriebmittel (n=4)

20 Proben ohne Haselnüsse Rohstoffe: falsch-positive Proben Leinsamen +++ Mandeln +++ Walnüsse +++ Cashewkerne +++ Pistazien + Pecannüsse + + = schwach positiv (vorgetäuschter Gehalt: 1,5 10 mg/kg) ++ = positiv (vorgetäuschter Gehalt: mg/kg) +++ = stark positiv (vorgetäuschter Gehalt: > 500 mg/kg)

21 Proben ohne Haselnüsse Zwischenprodukte und Backwaren: negative Proben Komplex zusammengesetzte Backmittel und Backmischungen Daraus hergestellte Teige, Massen Daraus hergestellte Backwaren: Kirschkuchen, Weizenmischbrot mit Sonnenblumenkernen, Weizenmischbrot mit Kürbiskernen Diese enthielten keine kreuzreaktiven Bestandteile (z.b Mandeln, Leinsamen etc.)

22 Proben ohne Haselnüsse Zwischenprodukte und Backwaren falsch-positive Proben Alle Produkte mit kreuzreagierenden Bestandteilen waren stark falsch positiv: Weizenmischbrot mit Leinsamen Butterquarkstollen mit Mandeln Vortäuschung von Haselnuss!!

23 Proben mit Haselnuss-Dotierung Alle Proben mit kreuzreagierenden Zutaten konnten hinsichtlich des Haselnussgehaltes nicht ausgewertet werden. Bei allen Proben ohne kreuzreagierende Zutaten konnte Haselnuss mit unterschiedlichen Wiederfindungen detektiert werden.

24 Wiederfindung der dotierten Haselnussgehalte während der Herstellung der Backwaren 120% 113% 110% 110% Wiederfindungsraten 100% 80% 60% 40% 20% 87% 93% 79% 26% 74% 14% 0% Produkte 1.1 Rührmix 2.1 Teigsäuerungsmittel 3.1 Teigsäuerungsmittel 1.2 Rührmasse 2.2 Weizenmischbrotteig mit Sonnenblumenkernen 1.3 Kirschkuchen 2.3 Weizenmischbrot mit Sonnenblumenkernen 3.2 Weizenmischbrotteig mit Kürbiskernen 3.3 Weizenmischbrot mit Kürbiskernen

25 Wiederfindung der Haselnüsse verschiedener Röstgrade CMC-Suspension, 10 ppm Wiederfindung (TS) in % Wiederfindung in Prozent, normiert auf die rohen Haselnüsse Röstzeit in Minuten

26 PCR Nachweisgrenze ppm Haselnuss Standard ppm Haselnuss Standard ppm Haselnuss Standard ppm Haselnuss Standard ppm Haselnuss Standard ppm Haselnuss Standard 7. Blindwert 8. Negativkontrolle 9. Positivkontrolle bp Leiter

27 Ergebnisse PCR Verifizierung falsch-positiver Ergebnisse der ELISA-Methode Probe Ergebnis Probe Ergebnis Leinsaat - Walnüsse - Cashewkerne - Quarkteigmasse mit Mandeln Pistazien - Butter-Quarkstollen mit Mandeln Mandeln - Weizenmischbrotteig mit Leinsaat Pecannüsse - Weizenmischbrot mit Leinsaat -

28 Ergebnisse Ringversuche n=3 Labore Alle Ergebnisse stimmen qualitativ überein. Die quantitativen Ergebnisse der ELISA-Methode zeigen z.t. hohe Schwankungsbreiten und verdeutlichen den eher semiquantitativen Charakter des Verfahrens.

29 Zusammenfassung ELISA-Methode Grundlegende Aussagen Semiquantitative Methode mit hohen Standardabweichungen und schwankenden Wiederfindungen. Bestimmung geringer Mengen an Haselnuss- Bestandteilen in komplexen Matrizes ist möglich, sofern keine kreuzreagierenden Stoffe vorhanden sind. Nachweisgrenze: 1,5 ppm Haselnuss (nicht Protein!!) Bestimmungsgrenze: 10 ppm Haselnuss Optimaler Konzentrationsbereich für eine Quantifizierung : ppm

30 Zusammenfassung ELISA-Methode Grundlegende Aussagen Ergebnisse sind abhängig von der Haselnuss-Sorte, dem Alter und dem Verarbeitungsgrad der Nüsse. Probenziehung und Vorbereitung: Feinste Zerkleinerung und Homogenisierung bei inhomogenen Produkten erforderlich!! Extrem sorgfältige und saubere Arbeitsweise erforderlich! Gefahr von Kreuzkontaminationen.

31 Zusammenfassung PCR-Methode Grundlegende Aussagen Hohe Spezifität, keine falsch positiven Befunde (eignet sich zur Absicherung von positiven ELISA- Tests) Qualitativer Nachweis, es gibt noch keine Quantifizierungsmöglichkeiten. Nachweisgrenze höher als bei ELISA (ca. 20 ppm ) Hoher zeitlicher, apparativer und personeller Aufwand: erfordert qualifiziertes Personal und sorgfältigste Arbeitsweise.

32 Fazit Das ELISA-Verfahren ist geeignet, selbst in komplexen Matrizes mit ausreichender Empfindlichkeit Haselnuss- Spuren nachzuweisen, die für Allergiker relevant sein können. Durch die starke Kreuzreaktivität des Tests mit diversen anderen Backrohstoffen muss ein positiver Befund mit PCR verifiziert werden. Das ELISA-Verfahren ist geeignet, Stufenkontrollen im Rahmen der Produktion durchzuführen, wenn sichergestellt ist, dass in den untersuchenden Prozessschritten die Anwesenheit von kreuzreagierenden Bestandteilen ausgeschlossen werden kann.

33 Fazit Es ist nicht auszuschließen, dass negative oder geringe Befunde mittels ELISA auch dadurch zustande kommen können, dass sich Hasselnussproteine während der Lagerung und in Verarbeitungsprozessen (z.b. Backen!!) verändern und so der Analytik entziehen. Insofern ist das Verfahren nicht absolut sicher geeignet, um ein für einen Allergiker absolut unbedenkliches Lebensmittel zu detektieren. Bezüglich zukünftiger Grenzwerte für Haselnuss- Spuren sind sowohl ELISA als auch PCR-basierte Verfahren nach dem derzeitigen Entwicklungsstand nur sehr bedingt geeignet, die Einhaltung von Grenzwerten mit der notwendigen Genauigkeit zu ermitteln.

34 Dank Backmittelinstitut e.v. für die Finanzierung der Materialien Fa. Jung Zeelandia für die Bereitstellung aller Proben und Durchführung der Backversuche CVUA Freiburg für Unterstützung und Teilnahme an Ringversuch Fa. r-biopharm für Rat und Hilfestellung