Vergleichsmaterialien für die Allergenanalytik: unverzichtbar für die Validierung und die Routineanalytik
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- Hans Hochberg
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1 Vergleichsmaterialien für die Allergenanalytik: unverzichtbar für die Validierung und die Routineanalytik Hans-Ulrich Waiblinger BfR Workshop Allergene in Lebensmitteln, Aktuelle Entwicklungen in der Analytik Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
2 Ergebnisse eines Proficiency Tests (FAPAS 2005, in mg Milchprotein pro kg Gebäckmischung) Kit 1 Kit 2 Kit 3 Kit 4 Kit 5 Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
3 Soll: 300 mg Soja/kg Ergebnisse von Proficiency Tests (2) (LVU 2010, Soja in Brühwürsten)
4 Referenzmaterial Definitionen Stoff oder Objekt mit definierten (bekannten) Eigenschaften, für den Einsatz als Maß oder Vergleichsgröße bei Messverfahren. Referenzmaterialien sind unverzichtbar bei chemischen Analysen sowie zur Qualitätskontrolle stellt den Bezug von Mess-Signal zu bekanntem Wert her Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
5 Referenzmaterial, Anforderungen definierte Zusammensetzung Homogenität Rückführbarkeit Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
6 Herstellung von Referenzmaterialien durch: Bundesanstalt für Materialforschung und Prüfung (D) Institute for Reference Materials and Measurements in Geel, B (EU) National Institute of Standards and Technology (NIST) (USA) CVUA Freiburg?? Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
7 Herstellung von Vergleichsmaterialien wie beginnen? Zielsetzung Forschungsvorhaben: molekularbiologische Analytik alle kennzeichnungspflichtigen Allergene einschließlich glutenhaltige Getreidearten, Ausnahme Milch und Ei Auswahl der dotierten Allergene: Material, das auch im Rahmen anderer Projekte eingesetzt wird (FH Projekt) Materialien aus der Lebensmittelindustrie, z.b. Krabbenpulver, Kabeljaupulver Nüsse: wichtiger deutscher Lebensmittelhersteller, jeweilige Sorte bekannt Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
8 Herstellung von Vergleichsmaterialien wie beginnen? Kriterien für Auswahl der Matrices: analytische Erfahrungen liegen schon vor möglichst Verarbeitungsprozess einschließen (brühen, backen) proteinhaltige bzw. kohlenhydrathaltige Matrix DNA-arm vs. DNA-reich Lagerfähighkeit Abstimmung zwischen den Projekten Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
9 Herstellung von Vergleichsmaterialien Modell Brühwurst allergene Bestandteile als feinpulvrige Materialien dotieren (Nüsse vor Feinmahlung entfetten) dotieren in Brät Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
10 Herstellung von Vergleichsmaterialien Modell Brühwurst mixen im Kutter ( Allergenbrät, z.b mg/kg) Mischungen mit Nullbrät im Kutter (verdünnen ) abfüllen brühen Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
11 Hauptanforderung Homogenität Durchführung von Homogenitätstests nach IUPAC 2006: 10 x 2 Teilproben = 20 Analysen pro Allergen und Dotierungsstufe
12 Homogenitätstests - Beispiel Proficiency Test FAPAS 2747 Gluten in Backmischung (ELISA)
13 Homogenitätstests Vergleich FAPAS Gluten (ELISA) / Brühwurst Soja 100 mg/kg Tetraplex PCR Proben-Nr. ELISA Gluten (mg/kg) Tetraplex real-time PCR Soja (Kopien/PCR) 2 Replika: 1 2 Repl Repl Repl Repl je separate Extraktion + Messung Mittel Cv 20 21
14 Homogenitätstests Streuung der Daten ist Material- und Methoden-bedingt Mittel ELISA Gluten (mg/kg) 189 Tetraplex realtime PCR Soja (Kopien/PCR) 83 Einfluss der Methode: Extraktion + PCR Cv Einfluss des Materials: Inhomogenitäten
15 Homogenitätstests Einfluss der Methode: analytische Standardabweichung Proben-Nr. ELISA Gluten (mg/kg) Tetraplex real-time PCR Soja (Kopien/PCR) Repl.1 Repl. 2 Repl. 1 Repl s an = analytische Standardabweichung, berechnet aus den Varianzen der Differenzen der Einzelwerte X 1 s an 39,7 14,5 s an 21 17,5 (rel %)
16 Homogenitätstests analytische Standardabweichung als Kriterium für Methodenauswahl ELISA Gluten (mg/kg) Tetraplex real-time PCR Soja (Kopien/PCR) s an 39,7 14,5 s an 21 17,5 (rel %) Zielgröße: s an < 0,5 s target S target = Zielstandardabweichung, z.b. Erfahrungswert aus Ringversuchen oder LVU, Annahme: 40 %
17 Homogenitätstests mittels real-time PCR, Vorüberlegungen Abschätzung des Methodeneinflusses auf Streuung der Daten: nur PCR: Verdünnungsreihe aus einem DNA-Extrakt Verdünnungsstufen sollen die Dotierungen simulieren DNA-Extraktion + PCR: eine Einwaage pro Dotierungsstufe, daraus Lysat herstellen und mehrere Aliquots aus Lysat präparieren Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
18 Methodeneinfluss auf Streuung der Daten, Beispiel 1: DNA aus Brühwurst 1000 mg/kg, DNA-Verdünnungen Verdünnungsstufe entspricht CT-Wert (c) pg/5µl (mg/kg) ,98 224, ,99 223, ,79 251, ,09 210, ,84 72, ,57 46, ,85 71, ,91 69, ,6 45, ,35 28, ,56 25, ,34 29, ,12 18, ,62 24, ,17 17, ,65 24, ,98 10, ,99 5, ,26 9, ,94 5, ,06 5, ,89 6, ,67 0, ,57 7,485 AllAll A Erdnuss Mittelwert (ct-wert) 29,96 32,04 33,21 33,89 35,54 36,80 Mittel (c) pg/5µl 227,23 65,08 32,28 21,09 7,89 4,96 relative STABW in % 7,61 19,15 28,01 17,80 30,50 60,53 VB (95%) rel., % 12,11 30,47 44,56 28,32 48,53 96,30 Verdünnungsstufe entspricht CT-Wert (c) pg/5µl (mg/kg) ,53 503, ,63 472, ,49 515, ,51 510, ,92 103, ,69 120, ,78 113, ,39 146, ,17 44, ,02 49, ,29 41, ,01 50, ,65 32, ,04 25, ,14 23, ,52 35, ,6 17, ,78 15, ,49 9, ,95 13, ,99 6, ,75 4, ,42 10, ,51 9,542 AllAll A Soja Mittelwert (ct-wert) Mittel (c) pg/5µl relative STABW in % VB (95%) rel., % 26,54 500,59 3,84 6,10 28,70 30,12 30,84 120,79 15,14 24,08 46,55 8,82 14,04 29,34 19,86 31,59 31,96 14,10 23,31 37,09 32,92 7,71 35,31 56,18
19 Methodeneinfluss auf Streuung der Daten, Beispiel 2: DNA aus Reiskeksen 480 mg/kg, DNA-Verdünnungen Verdünnungsstufe entspricht CT-Wert (c) cp/5µl (mg/kg) ,70 21, ,56 23, ,19 29, ,61 22, ,57 23, ,78 5, ,35 7, ,18 4, ,58 6, ,59 6, ,14 2, ,06 2, ,14 1, ,95 2, ,63 3, ,38 1, ,10 1, ,27 0, ,74 0, ,01 2, ,15 1, ,42 0, ,35 0, ,09 0,1 AllAll A Erdnuss Mittelwert (ct-wert) Mittel (c) cp/5µl 35,30 1,19 relative STABW in % 32,70 5,87 19,21 34,18 2,28 31,14 62,02 VB (95%) rel, %) 30,53 24,16 13,65 16,95 23,85 38,66 76, ,91 1,3 36,58 0,67 82,18 102,02 Verdünnungsstufe entspricht CT-Wert (c) cp/5µl (mg/kg) ,56 63, ,59 62, ,54 64, ,66 59, ,56 63, ,00 12, ,02 12, ,23 10, ,72 15, ,86 13, ,14 5, ,17 5, ,15 5, ,11 6, ,14 5, ,91 3, ,43 2, ,57 2, ,65 2, ,21 2, ,88 1, ,42 1, ,46 1, ,28 1,4 AllAll A Soja Mittelwert (ct-wert) Mittel (c) cp/5µl 30,97 12,96 relative STABW in % 12,81 32,14 5,89 1,32 33,35 2,67 20, ,41 1,3 34,29 1,43 17,37 VB (95%) rel, %) 28,58 62,75 3,17 3,94 15,90 1,64 25,90 21,57
20 Einfluss der Einwaage z.b. 32 ppm Dotierung - PCR: Lupine - Präparation: CTAB/QIA-Quick Statistische Kenngrößen (1. Meßreihe: 2 g EINW AAGE) Statistische Kenngrößen (2. Meßreihe: 250 mg EINW AAGE) Signifikanzniveau 5.0 % Signifikanzniveau 5.0 % Mittelw ert 8,1510 Mittelw ert 8,5530 Standardabw eichung (s) 0,4296 Standardabw eichung (s) 0,9555 Variationskoeffizient (VK) 5,27 % Variationskoeffizient (VK) 11,17 % Vertrauensbereich (VBx) 0,3073 Vertrauensbereich (VBx) 0,6835 T - Faktor (t) 2,2620 T - Faktor (t) 2, Präparationen mit einer Einwaage von 2 g jeweils einfach in der PCR getestet. 10 Präparationen mit einer Einwaage von 250 mg jeweils einfach in der PCR getestet. Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
21 Homogenitätstests mittels real-time PCR, Vorüberlegungen Bestimmung Streuung insgesamt: Inhomogenität + DNA-Extraktion + PCR: mehrere Proben (bis zu 10) pro Dotierungsstufe präparieren Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
22 Homogenitätstests Vorabtests zur Streuung der Daten insgesamt Beispiel Brühwürste, Tetraplex real-time PCR Erdnuss Dotierung CT (1) CT (2) Mittel VK ppm CT 10 36,99 39, ,23 39,58 38,4 72,9% 10 38,68 38, ,38 37, ,73 39,12 37,9 70,3% 20 37,46 37, ,85 35, ,6 36,67 36,4 28,7% 32 35,91 36, ,45 34, ,85 34,94 34,8 25,2% ,28 35, ,79* 33, ,55 33,54 32,8 30,4% ,9 32,56 Soja Dotierung ppm CT (1) CT (2) Mittel CT VK 10 33,1 32, ,36 32,92 32,7 22,1% 10 32,51 32, ,55 32, ,96 33,04 32,3 40,6% 20 32,4 32, ,03 31, ,56 32,02 31,4 23,9% 32 31,4 31, ,65 29, ,95 30,4 30,0 21,8% ,03 30, ,86 28, ,46 29,95 28,6 29,1% ,7 28,37 VK = Variationskoeffizient, bezogen auf Messgröße: Kopienzahl
23 Homogenitätstests Heterogenitäts-Standardabweichung zur Abschätzung von Inhomogenitäten Proben-Nr. Tetraplex real-time PCR Soja (Kopien/PCR) 1 2 Mittel Repl Repl φ =83 s het 10,5 12,6 s het (rel %) Zielgröße: s het < 0,3 s target mit S target = 40 % s het < 12 %
24 Ansätze zur Quantifizierung: Kalibrator = DNA-Verdünnungsreihe aus einem dotierten Material Kalibrator: Brühwurst CVUA FR, je 1000 mg/kg DNA auf 250 ng/µl eingestellt, verdünnt auf Stufen äquivalent zu 320, 100, 32, 20 und 10 mg/kg Proben: durch Mischung aus Brühwurst mit Nullmaterial hergestellte Brühwürste (Stufen: s.o.) DNA je auf 250 ng/µl eingestellt Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
25 Ansätze zur Quantifizierung - Methode DNA- Extraktion CTAB/QIAQuick; eingestellt auf 250 ng/µl je 2 Präparationen pro Probe, jede Präparation einfach mittels PCR untersucht PCR: Tetraplex Kantonales Labor ZH (AllAll A, B, E) je 3 separate Läufe Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
26 Ansätze zur Quantifizierung: Kalibrator = DNA-Verdünnungsreihe aus einem dotiertem Material Tetraplex PCR AllAll A, B und E dotierte Brühwürste, Kalibrator: DNA aus Level 1000 mg/kg Mittelwerte aus 3 Läufen (Walnuss, Senf: n=1) 117 Ist (mg/kg) Soll: Dotierung mg/kg Soja (mg/kg) Erdnuss (mg/kg) Haselnuss (mg/kg) Sellerie (mg/kg) Mandel (mg/kg) Sesam (mg/kg) Walnuss (mg/kg) Senf (mg/kg) dotierte Materialien (mg/kg)
27 Ansätze zur Quantifizierung: Kalibrator = DNA-Verdünnungsreihe aus einem dotiertem Material Tetraplex PCR AllAll A, B und Ess Haselnuss dotierte Brühwürste, Kalibrator: DNA aus Level 1000 mg/kg Mittelwerte aus 3 Läufen (Walnuss, Senf: n=1) Ist (mg/kg) Soll: Dotierung mg/kg Soja (mg/kg) Erdnuss (mg/kg) Haselnuss (mg/kg) Sellerie (mg/kg) Mandel (mg/kg) Sesam (mg/kg) Walnuss (mg/kg) Senf (mg/kg) dotierte Materialien (mg/kg)
28 Hauptanforderung Richtigkeit Vergleich von bisher verfügbaren Materialien Brühwurst CVUA FR Brüh-/Rohwürste KL AG/ZH Kalibrator: Brühwurst CVUA FR, je 1000 mg/kg DNA auf 250 ng/µl eingestellt, verdünnt auf Stufen: 320, 100, 32, 20, 10 Proben = Würste CH: - Kalibrierwürste: Brühwurste und Rohwürste - je mg/kg - Proben: B = Landjäger, C = Salami Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
29 Richtigkeit: Vergleich von dotierten Materialien DNA- Extraktion Würste CH: CTAB/QIAQuick; eingestellt auf 250 ng/µl je 2 Präparationen, jede Präparation einfach mittels PCR untersucht PCR: Tetraplex KL CH (AllAll A, B, E) Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
30 Soja, Sellerie Soja, kalibriert mit Wurst CVUA Soja Soll Soja Ist Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A Kal RW C Kal RW E 0 0 ERFA Probe B ERFA Probe C Sellerie, kalibriert mit Wurst CVUA Sellerie Soll Sellerie Ist Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A Kal RW C Kal RW E 180 ERFA Probe B ERFA Probe C
31 Haselnuss, Erdnuss Haselnuss, kalibriert mit Wurst CVUA Haselnuss Soll Haselnuss Ist Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A Kal RW C Kal RW E ERFA Probe B ERFA Probe C Erdnuss, kalibriert mit Wurst CVUA Erdnuss Soll Erdnuss Ist Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A Kal RW C Kal RW E 0 0 ERFA Probe B ERFA Probe C
32 Mandel, Sesam Mandel, kalibriert mit Wurst CVUA Kal BW A Kal BW C Kal BW E 1256 Kal RW A Kal RW C Kal RW E ERFA Probe B ERFA Probe C Mandel Soll Mandel Ist Sesam, kalibriert mit Wurst CVUA Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A 100 Kal RW C Kal RW E ERFA Probe B ERFA Probe C Sesam Soll Sesam Ist
33 Walnuss, Senf Walnuss, kalibriert mit Wurst CVUA Walnuss Soll Walnuss Ist Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A Kal RW C Kal RW E ERFA Probe B ERFA Probe C Senf, kalibriert mit Wurst CVUA Senf Soll Senf Ist Anmerkung zu Proben CH: dotiert wurde Mischung aus schwarzem und wenig weißem Senf 0 Kal BW A Kal BW C Kal BW E Kal RW A Kal RW C Kal RW E ERFA Probe B ERFA Probe C
34 Richtigkeit: Vergleich von dotierten Materialien Fazit: gute Übereinstimmung (Wiederfindung %) bei: - alle Brühwurstmaterialien Soja, Sellerie, Erdnuss, Mandel, Walnuss - Kal BW Haselnuss Wf ca. 30 %, Sesam ca. 200% - bei Rohwürsten schlechtere Wiederfindung als bei Brühwurst - Ausnahme: Senf Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt Freiburg
35 Herstellung von Vergleichsmaterialien für die Allergenanalytik eine Herculesaufgabe? für jedes zu dotierende Allergen theoretisch Vielzahl von Materialien (Sorten, Verarbeitungszustände), die in Frage kommen beliebiges Material, z.b. aus Lebensmittelindustrie für Dotierung auswählen, mit Responseverhalten anderer Dotierungsmaterialien/ Sorten vergleichen unterschiedlichste Matrices sollten berücksichtigt werden zunächst wenige wichtige Matrices herstellen, ggf. genügt eine Dotierungsstufe Aktivitäten koordinieren!!
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