Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung. DLA 02/2014 Allergene II. Soja und Weizen. in "gluten-freier" Backware

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1 DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung 02/2014 Allergene II: Soja und Weizen in "gluten-freier" Backware Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Pinnberg Großhansdorf, Germany proficiency-testing@dla-lvu.de Koordinator der LVU: Dr. Matthias Besler Seite 1 von 42

2 Inhalt 1. Einleitung Durchführung Untersuchungsmaterial Homogenität Untersuchung Ergebnisübermittlung Auswertung Bezugswert (zugewiesener Wert) Standardabweichung Ausreißer Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Allgemeines Modell nach Horwitz Auswertung eines Versuchs zur Präzision Werte aus Erkenntnissen z-score Quotient Standardunsicherheit Graphische Darstellung der Bezugswerte Wiederfindungsraten: Dotierung Ergebnisse Vergleichsuntersuchung Soja ELISA-Ergebnisse: Soja (als Sojaprotein) PCR-Ergebnisse: Soja Vergleichsuntersuchung Weizen ELISA-Ergebnisse: Gluten PCR-Ergebnisse: Weizen Dokumentation ELISA: Soja ELISA: Gluten PCR: Soja PCR: Weizen Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Verzeichnis relevanter Literatur...41 Seite 2 von 42

3 1. Einleitung Die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen (LVU) ist ein unverzichtbarer Baustein für das Qualitäts-Management-System eines jeden, mit der Untersuchung von Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetik und Bedarfsgegenständen befassten Labors. Die Durchführung von Laborvergleichsuntersuchungen ermöglicht den teilnehmenden Instituten die eigene analytische Kompetenz unter realen Bedingungen nachzuweisen. Gleichzeitig erhalten sie wertvolle Daten zur Validität der durchgeführten Untersuchungsmethode. Das Ziel von DLA ist es, LVU für ausgesuchte Parameter in praxisrelevanten Konzentrationen anzubieten. Durchführung und Auswertung der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung erfolgten nach den technischen Anforderungen der DIN EN ISO/IEC (2010) und DIN ISO Durchführung 2.1 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung wurden zwei LVU-Proben für den Nachweis von Allergenen im mg/kg-bereich und eine Dotierungsmaterialprobe zur Verfügung gestellt. Die Dotierungsmaterialprobe enthält die betreffenden allergenen Zutaten im Bereich von 1-10 % und wurde der dotierten LVU-Probe zugesetzt. Die Untersuchungsergebnisse der Dotierungsmaterialprobe sollen im Vergleich zur dotierten LVU-Probe die Möglichkeit geben, die Nachweisbarkeit der Allergene ohne und mit Einfluss der Lebensmittelmatrix bzw. -prozessierung zu charakterisieren. Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um eine handelsübliche Backmischung, die als "glutenfrei" gekennzeichnet ist. Die Grundzusammensetzung war für beide Proben A und B gleich (s. Tabelle 1). Probe B wurde das Dotierungsmaterial mit den allergenen Zutaten Sojamehl und Weizenmehl zugesetzt. Die Zusammensetzung der Dotierungsmaterialprobe und die Gehalte der allergenen Zutaten in Probe B sind Tabelle 2 zu entnehmen. Die Proben wurden nach dem Homogenisieren zu Portionen von ca. 25 g abgefüllt. Seite 3 von 42

4 Tabelle 1: Zusammensetzung der DLA-Proben Zutaten Probe A Probe B Backmischung "Marmorkuchen", glutenfrei Zutaten: Backmischung (93%) - Maisstärke, Zucker, Maismehl, Reismehl, Feuchthaltemittel: Sorbit, Säuerungsmittel: Diphosphate, Backtriebmittel: Natriumhydrogencarbonat, Verdickungsmittel: Guarkernmehl, Aroma, Salz; Kakaomischung (7%) - Zucker, fettarmes Kakaopulver 100 g/100g 99,2 g/100g Tabelle 2: Zugesetzte Mengen allergener Zutaten Zutaten Dotierungsmaterialprobe Probe B Kartoffelmehl 83 % 0,80 % Soja: als Sojamehl davon Sojaproteine mg/kg (6,21 %) mg/kg 497 mg/kg 199 mg/kg Volleipulver 3,41 % 0,027 % Magermilchpulver 4,84 % 0,039 % Weizen: als Weizenmehl Typ 550 davon Gesamtprotein davon Gluten** mg/kg (2,65 %) 2809 mg/kg 2528 mg/kg 212 mg/kg 22,5 mg/kg 20,3 mg/kg * gemäß Deklaration ** Definition für "Gluten" der Glutenunverträglichkeit-Kennzeichnungs-Verordnung (EU/41/2009) entspricht laut Literaturdaten ca % des Weizenproteins Homogenität Die Homogenität der dotierten Probe B wurde mittels ELISA-Tests als 5fach-Bestimmung geprüft (s. Abb. 1) und mit einer Standardabweichung zwischen den Proben von < 15% für das verwendete Verfahren als hinreichend gesichert angesehen (17, 18, 20). Seite 4 von 42

5 Homogenitätsprüfung - ELISA Ergebnisse in % des MW Soya, SD=15 Unabhängige Proben, n = 5 Abb. 1: Homogenitätsprüfung der DLA-Probe B Darstellung der Ergebnisse relativ in Prozent des arithmetischen Mittelwerts 2.2 Untersuchung An jedes teilnehmende Institut wurden in der 12. Kalenderwoche 2014 je eine Portion der Untersuchungsmaterialien A und B sowie eine Dotierungsmaterialprobe verschickt. Die Untersuchungsverfahren wurden freigestellt. Die Untersuchungen waren durchzuführen bis spätestens 5. Mai Ergebnisübermittlung Die Ergebnisabgabe erfolgte einheitlich auf, an die teilnehmenden Institute versandten Übermittlungsbögen bzw. -dateien. Zur Auswertung kamen einerseits die Ergebnisse als positiv/negativ Angaben und andererseits angegebene Gehalte an allergenen Zutaten in mg/kg z.b. als Sojaproteine bzw. Gluten. Abgefragt und dokumentiert wurden die o.g. Ergebnisse sowie Angaben zu den Testmethoden wie Spezifitäten, Testkit-Hersteller und Stichpunkte zur Durchführung der Methoden. Falls Teilnehmer mehrere Ergebnisse für denselben Parameter abgegeben haben, die mit unterschiedlichen Methoden erhalten wurden, wurden diese Ergebnisse mit derselben Auswertenummer mit einem Buchstaben als Suffix unter Angabe der jeweiligen Methode ausgewertet. Alle Teilnehmer haben fristgerecht Ergebnisse abgegeben. Seite 5 von 42

6 3. Auswertung Verschiedene ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln können verschiedene Antikörper-Spezifitäten aufweisen, mit unterschiedlichem Referenzmaterial kalibriert worden sein und sich unterschiedlicher Extraktionsverfahren bedienen. Die verschiedenen ELISA- Methoden können daher zu einer unterschiedlichen Bewertung des Gehalts eines Analyten führen. Aus diesem Grund werden die Ergebnisse, wenn möglich in der Auswertung verschiedenen Bezugswerten gegenübergestellt. Dadurch soll jedes einzelne Ergebnis im Vergleich mit dem Mittelwert aller eingesandten Ergebnisse und/oder im Vergleich mit dem Mittelwert aller Ergebnisse derselben Methode bewertet werden können. Zum Vergleich mit der rechnerisch zugesetzten Menge wurde diese in den graphischen Darstellungen der Ergebnisse mit angegeben. Für die ELISA-Ergebnisse der Dotierungsmaterialprobe und der dotierten Probe wurden anhand der bekannten Zusammensetzung Wiederfindungsraten berechnet und zur Information angegeben. Hierbei erfolgte keine statistische Auswertung. Die angegebenen Wiederfindungsraten dienen ausschließlich einer Einschätzung von Matrix- und/oder Prozessierungseinflüssen. Die PCR-Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. 3.1 Bezugswert (zugewiesener Wert) Da es sich bei dem untersuchten Material nicht um zertifiziertes Referenzmaterial handelt wird als Bezugswert (X) für die Auswertung der robuste Mittelwert der eingesandten Ergebnisse verwendet (6). Sofern eine Prüfung der Verteilung der eingesandten Ergebnisse Hinweise für Quellen von höherer Variabilität, wie z.b. eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, ergibt, werden zusätzlich als Bezugswerte die robusten Mittelwerte von Einzelmethoden herangezogen. Bei den ELISA-Methoden zur Bestimmung von Allergenen wird, wenn möglich, stets so vorgegangen: i) Robuster Mittelwert aller Ergebnisse - X ALL ii) Robuster Mittelwert von Einzelmethoden - X METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. Einzelergebnisse die außerhalb des angegebenen Messbereiches eines teilnehmenden Labors liegen (z.b. mit der Angabe > 25 mg/kg oder < 2,5 mg/kg) werden für die statistische Auswertung berücksichtigt, sofern eine Angabe mit > oberhalb und eine Angabe mit < unterhalb des Zielbereichs liegt. 3.2 Standardabweichung Zum Vergleich mit der Zielstandardabweichung wird ebenfalls die robuste Standardabweichung (S x ) berechnet (6). Folgende robuste Standardabweichungen werden herangezogen: Seite 6 von 42

7 i) Robuste Standardabweichung aller Ergebnisse - S x ALL ii) Robuste Standardabweichung von Einzelmethoden - S x METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. 3.3 Ausreißer Auf Ausreißer wird mittels Mandel s-h-statistik Signifikanz-Niveau 95% geprüft (5). Ermittelte Ausreißer werden informativ genannt sofern gleichzeitig der z-score des Instituts < -2 oder > 2 ist. 3.4 Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Die Zielstandardabweichung des Bezugswertes wird nach unten dargestellten, unterschiedlichen Verfahren bestimmt Allgemeines Modell nach Horwitz Die relative Zielstandardabweichung in % des Bezugswertes wird i.d.r. nach folgender Gleichung (Horwitz ) berechnet σ (%) = 2 (1-0,5logX) hieraus wird die Zielstandardabweichung in mg/kg berechnet σ = X * σ (%) / 100. Die Zielstandardabweichung nach Horwitz wird z.z. in der Praxis von ELISA-Verfahren mit Messwerten im mg/kg Bereich nur in Ausnahmefällen erreicht Auswertung eines Versuchs zur Präzision Aus der Vergleichstandardabweichung σ R und der Wiederholstandardabweichung σ r eines Versuchs zur Präzision einer Methode (z.b. aus Ringversuchen nach ASU 64 LFGB) wird die Standardabweichung zwischen Laboratorien σ L berechnet: L = R 2 r 2. Aus den obigen Größen und der Anzahl der Wiederholmessungen n der laufenden Vergleichsuntersuchung wird nun die Zielstandardabweichung berechnet: = L 2 r 2 /n. Da in der vorliegenden Vergleichsuntersuchung die Anzahl der Wiederholmessungen n = 1 ist, ist die Vergleichsstandardabweichung σ R gleich der Zielstandardabweichung σ. Seite 7 von 42

8 Nachstehend sind die relativen Vergleichsstandardabweichungen aus Ringversuchen einiger ELISA-Methoden nach ASU 64 angegeben (13, 14, 15): Methode Parameter Matrix Mittelwerte Relative σ R Literatur ELISA Sojaprotein Brühwurst 0,36-4,07% 14-28% L ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. B) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) Erdnuss Erdnuss Erdnuss Haselnuss Haselnuss Vollmilchschokolade Vollmilchschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade 5,9-174 mg/kg 20-31% L ,1-216 mg/kg 14-32% L ,7-148 mg/kg 22-33% L ,6-16,3 mg/kg 12-33% L ,4-21,3 mg/kg 14-19% L Aus den o.g. Präzisionsdaten der ASU 64 Methoden ergeben sich relative Zielstandardabweichungen im Bereich von 12-33%. Für den auch in der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung bestimmten Analyten Soja lagen die relativen Vergleichsstandardabweichungen im Bereich von 14-28% in der Matrix Brühwurst (15). Das IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) hat in einem Ringversuch die Eignung fünf verschiedener ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Erdnuss getestet (16). Die Mittelwerte lagen im Konzentrationsbereich von 0,3-16,1 mg/kg bzw. 1,2-20,4 mg/kg. Die jeweils niedrigsten relativen Vergleichsstandardabweichungen der fünf Test-Kits lagen für die Matrix Bitterschokolade bei 20-42% und für Kekse bei 23-61%. Die Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity (WGPAT) hat Ringversuche zur Validierung von zwei kommerziellen ELISA-Test-Kits zur Gluten- Bestimmung mittels monoklonalem R5 Antikörper durchgeführt (21). Es wurden 12 Lebensmittelproben mit Gliadingehalten im Bereich von mg/kg von 20 Laboratorien untersucht. Die Wiederfindungsraten lagen zwischen 65 und 110%, die relativen Wiederholstandardabweichungen lagen bei 13-25% (1. Methode) bzw % (2. Methode) und die relativen Vergleichsstandardabweichungen bei 23-47% (1. Methode) bzw % (2. Methode). Laut den Autoren erfüllten beide ELISA-Test-Kits damit die Validierungskriterien für ELISA Methoden (21) Werte aus Erkenntnissen Die Zielstandardabweichung kann für die Eignungsbeurteilung auf einen Wert festgesetzt werden, der dem Leistungsfähigkeitsniveau entspricht, das der Koordinator für ein wünschenswertes Ziel für die teilnehmenden Laboratorien hält (6). Anforderungen an die Leistungsfähigkeit der Analysenmethoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln mittels ELISA sind u.a. vom Ministry of Health and Welfare (MHLW) in Japan (17), von der Arbeitsgruppe 12 Lebensmittelallergene des Technischen Komitees CEN/TC Seite 8 von 42

9 275 (18, 19) und von einer internationalen "Food Allergen Working Group" unter der Leitung der AOAC Presidential Task Force on Food Allergens (20) erarbeitet worden. Die hier relevanten ELISA-Validierungskriterien der drei Gremien sind nachstehend angegeben: Literatur (17, 18, 20) Wiederfindungsrate Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung MHLW % 25% CEN % AOAC % 6,9-34,4% (a) 19,5-57,2 (a) (a) = Beispiel aus hypothetischem Ringversuch im Konzentrationsbereich von 0,5-5 mg/kg Aufgrund der derzeitigen Leistungsfähigkeit von ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln, die sich aus den Präzisionsdaten von Versuchen und aus den o.g. Validierungsanforderungen ableiten lässt, legen wir für die relative Zielstandardabweichung σ einen Wert von 25% fest. Diese Zielstandardabweichung wurde zur statistischen Bewertung der Ergebnisse mittels z-score herangezogen und auf alle unter 3.1 angegebenen Bezugswerte angewandt. 3.5 z-score Der z-score wird herangezogen zur Beurteilung der Ergebnisse der teilnehmenden Institute. Er besagt um welches Vielfache der Zielstandardabweichung ( σ ) das Ergebnis (x) des betreffenden teilnehmenden Instituts vom Bezugswert (X) abweicht (6). Die Berechnung erfolgt nach z = (x X) / σ ; die Anforderungen an die Analytik gelten im Allgemeinen als erfüllt, wenn -2 z 2. Zur Bewertung wurden nachstehende z-scores mit einer Zielstandardabweichung von 25% in der Auswertung angegeben: i) z-score - z ALL (bezogen auf alle Ergebnisse) ii) z-score - z METHOD i (bezogen auf Einzelmethoden) 3.6 Quotient S x / In Anlehnung an den Horrat-Wert kann die Bewertung einer Laborvergleichsuntersuchung als aussagekräftig gelten, wenn der Quotient von robuster Standardabweichung und Zielstandardabweichung nicht über 2 liegt. Ein über 2 liegender Wert bedeutet, dass die Präzision nicht zufriedenstellend ist, d.h., dass die Präzision aus analytischen Gründen Seite 9 von 42

10 zu variabel ist oder die festgestellte Variation höher ist als für die angewandte Methode geschätzt wurde. Somit ist eine Vergleichbarkeit der Messergebnisse nicht gewährleistet (11). 3.7 Standardunsicherheit Jeder Bezugswert ist mit einer Standardunsicherheit behaftet, die von der Analysenmethode, Unterschieden der eingesetzten Analysenmethoden, dem Probenmaterial und der Anzahl der Teilnehmer (P) einer LVU beeinflußt wird. Die Standardunsicherheit (U x ) wird für die vorliegende LVU wie folgt berechnet (6). u X =1,25 S x / p Ist u X 0,3 muss die Standardunsicherheit des Bezugswertes nicht berücksichtigt werden (6). 3.8 Graphische Darstellung der Bezugswerte Die Bezugswerte werden als farbige Linien in den Abbildungen der Ergebnisse dargestellt. Dies ermöglicht einen optischen Vergleich der Einzelergebnisse mit den verschiedenen Bezugswerten für das Zusatzniveau eines Analyten einerseits und die robusten Mittelwerte über alle Methoden bzw. über Einzelmethoden andererseits. 3.9 Wiederfindungsraten: Dotierung Für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe werden Wiederfindungsraten in Bezug auf die zugesetzten Allergene berechnet. Die Bezugswerte ergeben sich aus den unter 2.1 Untersuchungsmaterial in Tabelle 1 angegebenen Gehalten. Als Akzeptanzbereich AB für die Bewertung der Teilnehmerergebnisse wird der von der AOAC vorgeschlagene Bereich von % für die Wiederfindungsraten von Allergen-ELISAs herangezogen (20). Seite 10 von 42

11 4. Ergebnisse Alle folgenden Tabellen sind anonymisiert. Den teilnehmenden Instituten wird mit dem Versand dieser Auswertung ihre individuelle Auswertenummer mitgeteilt. Die folgenden Ergebnisseiten sind für die allergenen Bestandteile jeweils gleich aufgebaut. Es werden zunächst die Ergebnisse aller Methoden zu einem Parameter für die Probe A und dann für die Probe B angegeben. ELISA-Ergebnisse, die als Sojamehl oder Gliadin angegeben wurden, sind in Sojaproteine bzw. Gluten unter Berücksichtigung der Angaben des betreffenden Testkit-Herstellers umgerechnet worden. Die Originalergebnisse sind der Dokumentation zu entnehmen. Die Auswertung erfolgte getrennt nach ELISA und PCR-Ergebnissen. Die Ergebnisse wurden nach durchgeführten Methoden zusammengefasst und die Auswertenummern innerhalb der Gruppen aufsteigend sortiert. Die Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. Für jeden Teilnehmer wird in Bezug auf die Konsens-Ergebnisse eine qualitative Bewertung vorgenommen. Hier wurde die Übereinstimmung mit den Konsens-Werten in Prozent angegeben. Gegebenenfalls werden anschließend die Ergebnisse aller Methoden und von Einzelmethoden mit mindestens 5 quantitativen Ergebnissen statistisch ausgewertet. In den Fällen, in denen eine statistische Auswertung der quantitativen Messergebnisse durchgeführt wurde, werden die Ergebnisse tabellarisch folgendermaßen aufgeführt : Ausw ertenummer Ergebnis Ergebnis z-score z-score Methode Hinw eis X ALL X M i pos/neg [mg/kg] X All X Method i Seite 11 von 42

12 Die Kenndaten der jeweiligen Vergleichsuntersuchung werden aufgeführt, falls wenigstens 50% positive Ergebnisangaben und mindestens 5 quantitative Messergebnisse vorliegen: Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode i [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Method i Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse Robuster Mittelwert (X) Robuste Standardabweichung (S x ) Median Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) untere Grenze des Zielbereichs (X - 2 σ ) obere Grenze des Zielbereichs (X + 2 σ ) Quotient S x / σ Standardunsicherheit u X Quotient u X / Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Im Anschluss erfolgt die Darstellung der Wiederfindungsraten für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe. Die Anzahl der Ergebnisse im Akzeptanzbereich von % wird aufsummiert. Seite 12 von 42

13 4.1 Vergleichsuntersuchung Soja ELISA-Ergebnisse: Soja (als Sojaprotein) Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 3 negativ <0,27 positiv 4,1 2/2 (100%) AQ 4 negativ <2,5 positiv 12 2/2 (100%) ES 5 negativ < 2,5 positiv 12 2/2 (100%) ES 6 negativ <1,25 positiv 9,4 2/2 (100%) ES 26 negativ positiv 5,85 2/2 (100%) ES 24 negativ positiv 164 2/2 (100%) IL Ergebnis umgerechnet 1 negativ <2,5 positiv 216,58 2/2 (100%) RS 9 negativ <2,5 positiv 103 2/2 (100%) RS 11 negativ <2,5 positiv 194,8 2/2 (100%) RS 16 negativ <2,5 positiv 206 2/2 (100%) RS Ergebnis umgerechnet 17 negativ <2,5 positiv 168,62 2/2 (100%) RS 18 negativ < 5.00 positiv 138,04 2/2 (100%) RS 20 negativ < NWG positiv 209 2/2 (100%) RS 22 negativ <2,5 positiv 104 2/2 (100%) RS 28 negativ <NG positiv >20 2/2 (100%) RS 7 negativ <1,0 positiv 7,8 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet 10 negativ positiv 2/2 (100%) VT 13 negativ <1,0 positiv 10,4 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet 19 negativ <1,0 positiv 11,2 2/2 (100%) VT Ergebnis umgerechnet Probe A Probe B Anzahl positiv 0 19 Anzahl negativ 19 0 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsensw erten Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Sojaprotein mittels ELISA zu je 100% negative Ergebnisse für Probe A und positive für Probe B erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Seite 13 von 42

14 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Sojaprotein [mg/kg] z-score X ALL Bezug X ALL z-score X RS X Methode RS Methode 3 4,1 AQ 4 12 ES 5 12 ES 6 9,4 ES 26 5,85 ES Hinweis IL Ergebnis umgerechnet 1 216,58 1,2 RS ,5 RS ,8 0,6 RS ,9 RS Ergebnis umgerechnet ,62 0,0 RS ,04-0,7 RS ,0 RS ,5 RS 28 >20 RS 7 7,8 VT Ergebnis umgerechnet 10 VT 13 10,4 VT Ergebnis umgerechnet 19 11,2 VT Ergebnis umgerechnet Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen Seite 14 von 42

15 Kenndaten: Quantitative Auswertung Soja (als Sojaprotein) Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 17 8 Robuster Mittelwert (X) 92,8 168 Robuste Standardabweichung (S x ) 98,7 53,2 Median Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 42,0 untere Grenze des Zielbereichs 84,0 obere Grenze des Zielbereichs 252 Quotient S x / σ 1,3 Standardunsicherheit u X 23,5 Quotient u X / σ 0,56 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS = R-Biopharm, Ridascreen Fast 8 (100%) Anmerkung: Die Auswertung aller Ergebnisse zeigte eine bimodale Verteilung der Ergebnisse im Bereich von 4-12 mg/kg und mg/kg. Eine gemeinsame Auswertung und Bewertung der Ergebnisse aller Methoden war daher nicht möglich. Robuster Mittelwert und Standardabweichung wurden rein informativ angegeben. Die Auswertung Ergebnisse von Methode RS zeigte eine geringe Variabilität der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ lag deutlich unter 2,0. Der Mittelwert der Auswertung lag bei 84% des Zusatzniveaus (s. auch "Wiederfindungsraten für Sojaprotein" S.17). Seite 15 von 42

16 mg/kg Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results > Auswertenummer / Evaluation number Abb. 2: ELISA-Ergebnisse Soja (als Sojaprotein) grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 3: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Sojaprotein) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 16 von 42

17 Wiederfindungsraten für Sojaprotein: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis 3 521,1 2 4,1 2 AQ ES ES 6 >25 9,4 5 ES 26 5,85 3 ES IL Ergebnis umgerechnet , RS RS ,8 98 RS RS Ergebnis umgerechnet , ,62 85 RS ,04 69 RS RS RS 28 >20 >20 RS ,8 4 VT Ergebnis umgerechnet 10 VT 13 > ,4 5 VT Ergebnis umgerechnet ,2 6 VT Ergebnis umgerechnet AB* % AB* % Anzahl im AB 7 Anzahl im AB 9 Prozent im AB 50 Prozent im AB 53 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen Anmerkung: 7 Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backmischungs-Probe B lagen 9 Wiederfindungsraten in diesem Akzeptanzbereich. Seite 17 von 42

18 4.1.2 PCR-Ergebnisse: Soja Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Probe B pos / neg mg/kg pos / neg mg/kg Qualitative Bewertung Übereinstimmungen mit Konsenswerten Methode 14 negativ positiv 2/2 (100%) ASU-1 23 negativ positiv 2/2 (100%) ASU-1 15 negativ positiv 438 2/2 (100%) ASU positiv > 5 1/2 (50%) SFA 16 positiv 2,1 positiv 231 1/2 (50%) SFA 21 positiv 21,7 positiv > 400 1/2 (50%) SFA 2 negativ positiv /2 (100%) div 6 negativ - positiv + 2/2 (100%) div 8 negativ positiv /2 (100%) div 12 positiv positiv 1/2 (50%) div 13 negativ positiv 2/2 (100%) div 19 negativ - positiv - 2/2 (100%) div 25 negativ positiv 2/2 (100%) div Hinweis Probe A Probe B Anzahl positiv 3 13 Anzahl negativ 9 0 Prozent positiv Prozent negativ 75 0 Konsenswert negativ positiv Methoden: ASU-1 = ASU L , ASU-2 = ASU L SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Soja mittels PCR wurden 75% negative Ergebnisse für Probe A und 100% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Die quantitativen Ergebnisse wurden mit unterschiedlichen Bezügen, wie "DNA-Soja", "Sojabohne" oder "Sojamehl", angegeben. Seite 18 von 42

19 Wiederfindungsraten für Soja (als Sojabohne / Sojamehl): Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis 14 ASU-1 23 ASU ASU-2 5 > 5 > 5 SFA SFA 21 > 400 SFA div als DNA??? 6 div div 12 div 13 div 19 - div 25 div AB* % AB* % Anzahl im AB 1 Anzahl im AB 1 Prozent im AB 33 Prozent im AB 25 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: ASU-1 = ASU L , ASU-2 = ASU L SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Ein Teilnehmer hat in der Dotierungsmaterialprobe mittels PCR eine Wiederfindungsrate im Bereich von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backmischungs-Probe B lag ebenfalls eine Wiederfindungsrate im Akzeptanzbereich. Seite 19 von 42

20 4.2 Vergleichsuntersuchung Weizen ELISA-Ergebnisse: Gluten Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 16 negativ <4 positiv 36 2/2 (100%) AQ 28 positiv 6,8 positiv 39,14 1/2 (50%) AQ 10 negativ positiv 9 2/2 (100%) BK 24 negativ positiv 6 2/2 (100%) IL 1 negativ <5 positiv 23,05 2/2 (100%) RS 2 negativ positiv 30 2/2 (100%) RS 3 negativ <5,0 positiv 28 2/2 (100%) RS 4 negativ <5,0 positiv 32 2/2 (100%) RS 5 negativ < 3 positiv 33 2/2 (100%) RS 6 negativ <3 positiv 31,7 2/2 (100%) RS 7 negativ <5 positiv 25,65 2/2 (100%) RS 9 negativ <5,0 positiv 28,7 2/2 (100%) RS 11 negativ <5,0 positiv 34,1 2/2 (100%) RS 14 negativ positiv 30 2/2 (100%) RS 15 - positiv 33 1/2 (50%) RS 16 positiv 6,3 positiv 34 1/2 (50%) RS 17 negativ <5,0 positiv 26,06 2/2 (100%) RS 18 negativ < 5.00 positiv 25,46 2/2 (100%) RS 19 negativ <5 positiv 38 2/2 (100%) RS 20 negativ < NWG positiv 29 2/2 (100%) RS 23 negativ <5 positiv 30,5 2/2 (100%) RS 26 negativ positiv 25,5 2/2 (100%) RS 27 negativ <3 positiv 15 2/2 (100%) RS 13 negativ <5 positiv 25 2/2 (100%) VT 8 negativ negativ 1/2 (50%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 2 24 Anzahl negativ 22 1 Prozent positiv 8 96 Prozent negativ 92 4 Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsensw erten Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 20 von 42

21 Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Gluten mittels ELISA zu je 92% negative Ergebnisse für Probe A (mit 2 positiven Ergebnissen im Bereich der Bestimmungsgrenzen) und für Probe B 96% positive Ergebnisse (mit einem negativen Ergebnis) erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Gluten z-score z-score Methode Hinweis [mg/kg] X ALL Bezug X ALL X RS X Methode RS ,0 0,9 AQ 28 39,14 1,4 1,3 AQ ,8-2,8 BK ,2-3,2 IL 1 23,05-0,8-0,9 RS ,1 0,1 RS ,1-0,2 RS ,4 0,4 RS ,6 0,5 RS 6 31,7 0,4 0,3 RS 7 25,65-0,5-0,5 RS 9 28,7 0,0-0,1 RS 11 34,1 0,7 0,6 RS ,1 0,1 RS ,6 0,5 RS ,7 0,6 RS 17 26,06-0,4-0,5 RS 18 25,46-0,5-0,5 RS ,2 1,2 RS ,0-0,1 RS 23 30,5 0,2 0,1 RS 26 25,5-0,5-0,5 RS ,9-2,0 RS ,6-0,6 VT 8 div Ausreißer X Alle Ausreißer X Alle Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 21 von 42

22 Kenndaten: Quantitative Auswertung Gluten Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse Robuster Mittelwert (X) 29,0 29,4 Robuste Standardabweichung (S x ) 6,1 4,4 Median 29,5 30,0 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 7,25 7,35 untere Grenze des Zielbereichs 14,5 14,7 obere Grenze des Zielbereichs 43,5 44,1 Quotient S x / σ 0,84 0,60 Standardunsicherheit u X 1,56 1,26 Quotient u X / σ 0,21 0,17 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS = R-Biopharm, Ridascreen Fast 22 (92%) 19 (100%) Anmerkung: Die Auswertungen der Ergebnisse aller Methoden und von Methode RS zeigten eine geringe Variabilität der Ergebnisse. Die Quotienten S x / σ lagen unter 1,0. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist gegeben. Die Mittelwerte der Auswertungen lagen etwa ein Drittel über dem Zusatzniveau, wobei ein Gluten-Gehalt der Grundmatrix "Backmischung" (Probe A: 92% der Ergebnisse < 5 mg/kg)) im Bereich der Bestimmungsgrenzen nicht ausgeschlossen werden kann (s. auch "Wiederfindungsraten für Gluten" S.25). Seite 22 von 42

23 mg/kg Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results Auswertenummer / Evaluation number Abb. 5: ELISA-Ergebnisse Gluten grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3,0-4, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 6: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Gluten) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 23 von 42

24 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 7: z-scores (ELISA-Ergebnisse als Gluten) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS (R-Biopharm, Ridascreen Fast) Seite 24 von 42

25 Wiederfindungsraten für Gluten: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis AQ 28 >200 39, AQ BK IL 1 >80 23, RS 2 > RS 3 > RS RS RS ,7 159 RS , RS ,7 144 RS ,1 171 RS RS RS RS , , RS , , RS RS RS 23 >400 30,5 153 RS 26 25,5 128 RS RS VT 8 >2000 div Ergebnis umgerechnet AB* % AB* % Anzahl im AB 10 Anzahl im AB 12 Prozent im AB 67 Prozent im AB 50 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 25 von 42

26 Anmerkung: 67% der Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backmischungs-Probe B lagen 50% der Wiederfindungsraten in diesem Akzeptanzbereich. Da ein Gluten-Gehalt der Grundmatrix "Backmischung" (Probe A: 92% der Ergebnisse < 5 mg/kg)) im Bereich der Bestimmungsgrenzen nicht ausgeschlossen werden kann, lässt sich für Probe B abschätzen, dass der Akzeptanzbereich für die Wiederfindungsraten bis etwa 170% erweitert werden kann. Seite 26 von 42

27 4.2.2 PCR-Ergebnisse: Weizen Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 8 negativ positiv 400 2/2 (100%) MS 5 negativ < 0,4 positiv > 0,4 2/2 (100%) SFA 9 negativ <5,0 positiv 975 2/2 (100%) SFA 14 negativ positiv 2/2 (100%) SFA 16 positiv <2,0 positiv 54,5 1/2 (50%) SFA 21 negativ - positiv 102 2/2 (100%) SFA 2 negativ positiv 190 2/2 (100%) div 6 negativ positiv 2/2 (100%) div 12 negativ positiv 2/2 (100%) div 13 negativ positiv 2/2 (100%) div 15 negativ positiv 150 2/2 (100%) div 19a negativ positiv 2/2 (100%) div 19b negativ positiv 2/2 (100%) div 25 negativ positiv 2/2 (100%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 1 14 Anzahl negativ 13 0 Prozent positiv Prozent negativ 93 0 Konsenswert negativ positiv Methoden: MS = AllAll, Microsynth SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Übereinstimmungen mit Konsensw erten Ausreißer X Alle, Ergebnis umgerechnet Anmerkung: Zum Nachweis von Weizen mittels PCR wurden 93% negative Ergebnisse für Probe A (ein positives Ergebnis unter der Bestimmungsgrenze) und 100% positive Ergebnisse für Probe B erhalten. Seite 27 von 42

28 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Weizen z-score Methode Hinweis [mg/kg] ,9 MS 5 > 0,4 SFA ,8 SFA 14 SFA 16 54,5-2,8 SFA ,7 SFA ,2 div 6 div 12 div 13 div ,6 div 19a 19b X ALL Bezug X ALL Methoden: MS = AllAll, Microsynth SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode div div 25 div Ausreißer X Alle, Ergebnis umgerechnet Seite 28 von 42

29 Kenndaten: Quantitative Auswertung Weizen Probe B Kenndaten Bezugswert (X) Alle Ergebnisse [mg/kg] X ALL Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 5 * Robuster Mittelwert (X) 179 Robuste Standardabweichung (S x ) 151 Median 150 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 44,8 untere Grenze des Zielbereichs 89,5 obere Grenze des Zielbereichs 269 Quotient S x / σ 3,4 Standardunsicherheit u X 84,4 Quotient u X / σ 1,9 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich 3 (60%) * Teilnehmer 9 wurde nicht berücksichtigt Anmerkung: Es lagen nur 6 quantitative Ergebnisse vor, davon ein Ausreißer, der nicht berücksichtigt wurde. Die Auswertung der Ergebnisse aller Methoden zeigte eine hohe Variabilität der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ lag über 3. Die Vergleichbarkeit der Ergebnisse ist eingeschränkt. Seite 29 von 42

30 mg/kg Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results Auswertenummer / Evaluation number Abb. 8: PCR-Ergebnisse Weizen grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse 5,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 9: z-scores (PCR-Ergebnisse als Weizen) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 30 von 42

31 Wiederfindungsraten für Weizen: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis MS 5 > 0,4 > 0,4 SFA SFA 14 SFA ,5 26 SFA SFA div 6 div 12 div 13 div div 19a 19b Auswertenummer Dotierungsmaterial 25 div div div Ausreißer X Alle, Ergebnisse umgerechnet AB* % AB* % Anzahl positiv Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 2 Anzahl negativ Prozent positiv Prozent im AB 0 Prozent im AB 33 Prozent negativ Konsenswert * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: MS = AllAll, Microsynth SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Kein Teilnehmer hat in der Dotierungsmaterialprobe mittels PCR eine Wiederfindungsrate im Bereich von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Backmischungs-Probe B lagen zwei Wiederfindungsraten im Akzeptanzbereich. Seite 31 von 42

32 5. Dokumentation Angaben der Teilnehmer 5.1 ELISA: Soja Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 3 - <0,27-4,1-521,1 Angabe als AQ ROMERLABS 4 negativ <2,5 positiv 12 positiv 3025 Sojaprotein ES ELISA-Systems Soy (ESSOYPRD-48) 5 negativ < 2,5 positiv 12 positiv 3400 Sojaprotein ES ELISA-Systems Soy (ESSOYPRD-48) 6 negativ <1.25ppm positiv 9.4ppm positiv >25ppm Sojaprotein ES ELISA-Systems Soy (ESSOYPRD-48) 26 negativ positiv 5,85 - Sojaprotein ES ELISA-Systems Soy (ESSOYPRD-48) 24 negativ positiv 410 positiv Sojamehl IL Immunolab Soja ELISA SOJ- E01 1 negativ <2,5 positiv 216,58 positiv Sojaprotein RS Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 9 negativ <2,5 positiv 103 positiv Angabe als Sojaprotein RS Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 11 - <2,5-194, Angabe als RS r-biopharm, Lot: negativ <6,25 positiv 514 positiv Sojabohne RS Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm <2, , ,94 soya protein RS RIDASCREEN Fast Soya, r- biopharm R < , Sojaprotein RS Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 20 - < NWG Sojaprotein RS R7102 FAST Soya r- Biopharm AG 22 negativ <2,5 positiv 104 positiv Sojaprotein RS Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 28 - <NG - >20ppm - >20 ppm Sojaprotein RS Ridascreen Fast Soja / Soya (R7102), r-biopharm 7 negativ <2.5 positiv 19,15 positiv 3400 Sojamehl VT Veratox Soy, Neogen 10 negativ positiv positiv Angabe als VT VERATOX/NEOGEN 13 negativ <2.5 positiv 26 positiv >2500 (ca. 3600) Sojamehl VT Veratox Sojamehl, Neogen 19 negativ <2,5 positiv 28 positiv 5000 Sojamehl VT Neogen (Veratox) Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA Systems IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen Seite 32 von 42

33 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Sonstige Hinweise Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 3 AQ 4 ES Anti-Soja Trypsin Inhibitor und andere Sojaproteine nach Kit-Angaben 5 ES 6 ES 26 ES Mittelwert angegeben. Dotierungsmaterial nicht analysiert wegen Kontaminationsrisiko 24 IL Probenvorbereitung und Testdurchführung 1 RS wird wie im Test-Kit enthaltene Anleitung durchgeführt 9 RS Extraktion nach Anleitung des Herstellers Probe C: Aufarbeitung mit 0,1g statt mit 1,0g Einwaage : Ergebnis mg/kg 11 RS nach Testkitanleitung Dotierung 1:5000 Verdünnung lt. Manual Extraktion von polyphenolhaltigen 16 RS LM (unter Zusatz von Casein und PVP) für Dotierprobe 1/3000 verd. gemessen Probe A und B 17 RS according to kit 18 RS Gemäss Protokoll RIDASCREEN FAST Soya Mittelwert aus 6 Bestimmungen nach Testvorschrift 9.4 tannin- und 20 RS spezifisch polyphenolhaltige Lebensmittel z.b: Schokolade Dotierungsprobe: Mercaptoethanol 10 min. 22 RS Sojaprotein-Antikörper bei 100 ºC und Puffer; Proben A und B: Dotierungsprobe x verdünnt und Probe B x Mercaptoethanol 10 min. bei 100 ºC, Puffer 10 verdünnt und Casein-Polyvinylpyrrolidon 28 RS Nach Kit-Vorgabe Probe B Quantifizierung: 115,2 ppm 7 VT Sojaproteine nach Kit-Angaben Probe C stark verdünnt, daher ist das Ergebnis nur eine Schätzung 10 VT Soja 13 VT 19 VT nach Herstellerangabe Seite 33 von 42

34 5.2 ELISA: Gluten Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 16 negativ <4 positiv 36 positiv 948 Gluten AQ AgraQuant Gluten G12, RomerLabs 28-6,8-39,14 - >200ppm Gluten AQ AgraQuant Gluten G12, RomerLabs 10 negativ Angabe als BK BIOKITS/NEOGEN 24 negativ positiv 6 positiv 3000 Gluten IL Immunolab Gliadin GLU-E01 1 negativ <5 positiv 23,05 positiv >80 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 2 negativ positiv 30 positiv >800 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 3 - <5, > 80 Angabe als RS R-BIOPHARM 4 negativ <5,0 positiv 32 positiv 1875 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 5 negativ < 3 positiv 33 positiv 2300 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 6 negativ <3ppm positiv 31.7ppm positiv 1140ppm Gliadin RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 7 negativ <5 positiv 25,65 positiv 1541 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 9 negativ <5,0 positiv 28,7 positiv Angabe als Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 11 - <5,0-34, Angabe als RS r-biopharm, Lot: negativ positiv 30 positiv Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 15 - positiv 33 - Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 16 positiv 6,3 positiv 34 positiv 2165 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm <5, , ,34 gluten RS RIDASCREEN Gliadin, r- biopharm R < , ,52 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 19 negativ <5 positiv 38 positiv 1600 Gluten RS R-biopharm (R7001) 20 - < NWG Gluten RS R7001 Gliadin r-biopharm AG 23 negativ <5 positiv 30,5 positiv >400 Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 26 negativ positiv 25,5 - Gluten RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 27 - < Angabe als RS Ridascreen Gluten (R7001), r-biopharm 13 negativ <5 positiv 25 positiv 530 Gluten VT Veratox Gliadin R5, Neogen 8 negativ negativ positiv >1000 Gliadin div Hausmethode Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen IL = Immunolab RS = R-Biopharm, Ridascreen VT = Veratox, Neogen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 34 von 42

35 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Sonstige Hinweise Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 16 AQ lt. Manual mit Fischgelatine für Probe A und B Dotierprobe 1/40 verd. gemessen 28 AQ G12 Nach Kit-Vorgabe Probe Dotierungsprobe Quantifizierung : 1809 ppm 10 BK GLUTEN 24 IL Probenvorbereitung und Testdurchführung 1 RS wird wie im Test-Kit enthaltene Anleitung Probe A wurde mit RIDA QUICK Gliadin R7004 (qualitativ) durchgeführt. Verwendung Extraktionslösung durchgeführt R RS Coktail Solution & 80% Ethanol / 2 hs / 50 C&25 C Extraktion und ELISA wurden bei der postiven Proben (B und Dotierprobe) zweimal wiederholt. Die zusätzliche Verdünnung (1:10) hat bei der Dotierprobe keinen messbaren Wert gezeigt. Dier Glutengehalt war weiterhin viel zu hoch. Es kann daher von einem maximalen Gehalt an Gluten ausgegangen sein, der auch >800ppm liegt. 3 RS R5 Wir haben Probleme mit der Matrix 4 RS R5 Kit Protokoll (Mendez Cocktail) 5 RS 6 RS R5 7 RS Gliadin von Weizen und verwandten Prolaminen Probe C wurde stark verdünnt, daher ist das Nach Kit-Vorgabe von Roggen und Gerste Ergebnis nur eine Schätzung 9 RS Extraktion mit Cocktaillösung nach Anleitung Probe C: Aufarbeitung mit 0,025g statt mit 0,25g des Herstellers Einwaage : Ergebnis 4.553mg/kg 11 RS nach Testkitanleitung Dotiwerung 1:50 Verdünnung 14 RS R5 nach Arbeitsanleitung 30 ± 8 mg/kg 15 RS 16 RS lt. Manual mit Cocktail-Lsg. Dotierprobe 1/40 verd. gemessen 17 RS Nach Kit-Vorgabe Gemäss Protokoll RIDASCREEN Gliadin RS 04-18, Extration mit Cocktail (patented) Mittelwert aus 2 Bestimmungen (R7006, offizielle AOAC-Methode) 19 RS nach Herstellerangabe 20 RS monoklonal nach Testvorschrift Cocktailaufarbeitung 23 RS Extraktion mit Coktaillösung (AOAC Methode) Extraktion Probe B mit Milchpulver 26 RS Mittelwert wurde angegeben. Dotierungsmaterial nicht analysiert, wegen Kontaminationsrisiko 27 RS mit Zusatz von Extraktionsadditiv (in Anwesenheit 13 VT ohne Zusatz Extraktionsadditiv von Buchweizen, Kräutern, etc erforderlich) für Dotierungsprobe: 970 mg/kg 8 div Kaninchen polyklonal gegen Gliadin Methanol 70% Seite 35 von 42

36 5.3 PCR: Soja Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Dotierungsprobe Angabe quantitatives Meth. Methode Ergebnis als Abk. positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 14 negativ positiv positiv DNA-Soja ASU-1 andere: L negativ positiv positiv DNA-Soja ASU-1 ASU L Amtliche Sammlung von 15 negativ positiv n.u. Sojamehl ASU-2 Untersuchungsverfa hren: Methode L Sure Food Allergen, 5 - positiv > 5 positiv > 5 DNA-Soja SFA Congen / r- Biopharm Sure Food Allergen, 16 positiv 2,1 positiv 231 positiv Sojabohne, gesamt SFA Congen / r- Biopharm Sure Food Allergen, 21 positiv 21,7 positiv > Sojabohne, gesamt SFA Congen / r- Biopharm 2 negativ positiv 1333 positiv taoxonische DNA/20ng/µl Quanti>Tect totaler DNA Probe B= div MasterMix No ROX, 0,133% Dotierprobe= UNG Schritt 32,35% 6 negativ - positiv + positiv + DNA-Soja div interne Methode 8 negativ positiv 1400 positiv Sojamehl div AllGetrid 12 positiv positiv positiv div 13 negativ positiv positiv DNA-Soja div 19 negativ - positiv - positiv - DNA-Soja div interne Methode 25 negativ positiv positiv Angabe als div Hausmethode Methoden: ASU-1 = ASU L , ASU-2 = ASU L SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 36 von 42

37 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Target-Sequenz / -DNA 14 ASU-1 Lectin SureFood PREP Allergen 23 ASU-1 Lektin-Gen Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen Extraktion mit Machery& Nagel Nucleopin Food Kit 2 g Einwaage Sonstige Hinweise 15 ASU-2 Soja-Lectin Dotierungsprobe nicht untersucht bzw. für Quantifizierung verwendet. Matrix-Kalibratoren: Reiskeks, dotiert mit 400 ppm Weizen- bzw. Sojamehl 5 SFA 16 SFA Sure Food Prep allergen 100mg lt. Manual Dotierprobe 1/30 verd. gemessen 21 SFA - Extraktion mittels SureFood PREP Allergen SureFood ALLERGEN QUANT Soya (S3201) 2 div Lectin Gen Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen/Säulchen CleanUp/RealTImePCR Mulitplex System AllAllA (Microsynth AG, Schweiz)/45 Zyklen; Bestimmung in 20ng/µl totaler DNA photometrisch eingestellt 100ng DNA/PCR rxn 6 div interne Methode 8 div 63bp Wizard/ Rotorgene div First-DNA all tissue Kit, real-time PCR in Probe A positiv an der Nachweisgrenze 13 div Lectin 19 div DNA Extraktion: CTAB+ProtK, Chloroform, Wizard, Realtime-PCR 45 Cyclen 25 div RNAse, Proteinase, Silikasäulchen, Real Time PCR, 45 Zyklen Seite 37 von 42

38 5.4 PCR: Weizen Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Dotierungsprobe Angabe quantitatives Meth. Methode Ergebnis als Abk. positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 8 negativ positiv 400 positiv Weizenmehl MS AllAllC 5 negativ < 0,4 positiv > 0,4 positiv > 0,4 Sure Food Allergen, Weizen, Roggen, Gerste, SFA Congen / r- Hafer, Dinkel, Kamut DNA Biopharm SureFood Allergen 9 negativ <5,0 positiv 93 positiv Angabe als Gluten SFA Quant Gluten (S3206), r- Biopharm 14 negativ positiv positiv Sure Food Allergen, andere: DNA glutenhaltigen SFA Congen / r- Getreides Biopharm Sure Food Allergen, 16 positiv <2,0 positiv 54,5 positiv glutenhaltiges Getreide SFA Congen / r- Biopharm Sure Food Allergen, 21 negativ - positiv glutenhaltiges Getreide SFA Congen / r- Biopharm 2 negativ positiv 190 positiv taoxonische DNA/20ng/µl Quanti>Tect totaler DNA Probe B= div MasterMix No ROX, 0,019% Dotierprobe= UNG Schritt 16,7% 6 negativ - positiv + positiv + DNA-Weizen div internal method 12 negativ positiv positiv div 13 negativ positiv positiv DNA-Glia-Weizen div Alary et al. Cereal 15 negativ positiv n.u. Weizenmehl div Chemistry 79 (4), 2002, a negativ - positiv - positiv - DNA-Weizen div interne Methode 19b negativ - positiv - positiv - Weizen-, Roggen-, Gerstediv DNA interne Methode 25 negativ positiv positiv Angabe als div Hausmethode Methoden: MS = AllAll, Microsynth SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 38 von 42

39 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Sonstige Hinweise Target-Sequenz / -DNA z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen 8 MS 81bp, K00821 Wizard/ Rotorgene SFA SureFood Prep Allergen (S1012), r-biopharm, Probe A: Cp-Werte unterhalb des Standards 9 SFA mit SureFood QUANTARD Allergen 40 (S3301) S4; Aufarbeitung 1= 0,44mg/kg; Aufarbeitung als Referenz 2= 7,79mg/kg 14 SFA SureFood PREP Allergen 16 SFA Sure Food Prep allergen 100mg lt. Manual Dotierprobe 1/30 verd. gemessen 21 SFA - Extraktion mittels SureFood PREP Allergen SureFood ALLERGEN QUANT Gluten (S3206) Nucleospin Food Kit mit eigenen Optimierungen/Säulchen 2 div CleanUp/RealTImePCR Mulitplex System in Entwicklung/45 Zyklen; Bestimmung in 20ng/µl totaler DNA photometrisch eingestellt 100ng DNA/PCR rxn 6 div Hausmethode 12 div 13 div GliadinWeizen Dotierungsprobe nicht untersucht bzw. für Quantifizierung verwendet. Matrix-Kalibratoren: 15 div Weizen-Lipid-Transferprotein (ltp) Reiskeks, dotiert mit 400 ppm Weizen- bzw. Sojamehl. Unterster Quantifizierungsbereich (relativ starke Streuung der Messergebnisse) DNA Extraktion: CTAB+ProtK, Chloroform, 19a div Wizard, Endpunkt PCR 45 Cyclen + Agarosegel DNA Extraktion: CTAB+ProtK, Chloroform, 19b div Wizard, Endpunkt PCR 45 Cyclen + Agarosegel 25 div RNAse, Proteinase, Silikasäulchen, Real Time PCR, 45 Zyklen Seite 39 von 42