Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung. DLA 04/2014 Allergene IV. Sellerie, Senf und Sesam. in Instantsuppen-Pulver

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1 DLA Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Auswertungs-Bericht Laborvergleichsuntersuchung 04/2014 Allergene IV: Sellerie, Senf und Sesam in Instantsuppen-Pulver Dienstleistung Lebensmittel Analytik GbR Waldemar-Bonsels-Weg Ahrensburg, Germany Koordinator der LVU: Dr. Matthias Besler Seite 1 von 46

2 Inhalt 1. Einleitung Durchführung Untersuchungsmaterial Homogenität Untersuchung Ergebnisübermittlung Auswertung Bezugswert (zugewiesener Wert) Standardabweichung Ausreißer Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Allgemeines Modell nach Horwitz Auswertung eines Versuchs zur Präzision Werte aus Erkenntnissen z-score Quotient Standardunsicherheit Graphische Darstellung der Bezugswerte Wiederfindungsraten: Dotierung Ergebnisse Vergleichsuntersuchung Sellerie ELISA-Ergebnisse: Sellerie PCR-Ergebnisse: Sellerie Vergleichsuntersuchung Senf ELISA-Ergebnisse: Senf PCR-Ergebnisse: Senf Vergleichsuntersuchung Sesam ELISA-Ergebnisse: Sesam PCR-Ergebnisse: Sesam Dokumentation ELISA: Sellerie ELISA: Senf ELISA: Sesam PCR: Sellerie PCR: Senf PCR: Sesam Verzeichnis der teilnehmenden Institute in alphabetischer Reihenfolge Verzeichnis relevanter Literatur...46 Seite 2 von 46

3 1. Einleitung Die Teilnahme an Laborvergleichsuntersuchungen (LVU) ist ein unverzichtbarer Baustein für das Qualitäts-Management-System eines jeden, mit der Untersuchung von Lebensmitteln, Futtermitteln, Kosmetik und Bedarfsgegenständen befassten Labors. Die Durchführung von Laborvergleichsuntersuchungen ermöglicht den teilnehmenden Instituten die eigene analytische Kompetenz unter realen Bedingungen nachzuweisen. Gleichzeitig erhalten sie wertvolle Daten zur Validität der durchgeführten Untersuchungsmethode. Das Ziel von DLA ist es, LVU für ausgesuchte Parameter in praxisrelevanten Konzentrationen anzubieten. Durchführung und Auswertung der vorliegenden Laborvergleichsuntersuchung erfolgten nach den technischen Anforderungen der DIN EN ISO/IEC (2010) und DIN ISO Durchführung 2.1 Untersuchungsmaterial Zur Untersuchung wurden zwei LVU-Proben für den Nachweis von Allergenen im mg/kg-bereich und eine Dotierungsmaterialprobe zur Verfügung gestellt. Die Dotierungsmaterialprobe enthält die betreffenden allergenen Zutaten im Bereich von 1-10 % und wurde der dotierten LVU-Probe zugesetzt. Die Untersuchungsergebnisse der Dotierungsmaterialprobe sollen im Vergleich zur dotierten LVU-Probe die Möglichkeit geben, die Nachweisbarkeit der Allergene ohne und mit Einfluss der Lebensmittelmatrix bzw. -prozessierung zu charakterisieren. Bei dem Untersuchungsmaterial handelt es sich um ein handelsübliches Instantsuppen-Pulver "Broccoli-Creme-Suppe". Die Grundzusammensetzung war für beide Proben A und B gleich (s. Tabelle 1). Probe B wurde das Dotierungsmaterial mit den allergenen Zutaten Sellerie, Senf und Sesam zugesetzt. Die Zusammensetzung der Dotierungsmaterialprobe und die Gehalte der allergenen Zutaten in Probe B sind Tabelle 2 zu entnehmen. Die Proben wurden nach dem Homogenisieren zu Portionen von ca. 25 g abgefüllt. Seite 3 von 46

4 Tabelle 1: Zusammensetzung der DLA-Proben Zutaten Probe A Probe B Broccoli-Creme-Suppenpulver Zutaten: Pflanzenfett, Gemüse (Broccoli 7%, Blumenkohl, Zwiebeln, Lauch, Spinat), Reismehl, modifizierte Stärke, Süßmolkenpulver, Weizenmehl, jodiertes Speisesalz, Würze (Soja), Milchzucker, Milcheiweiß, Verdickungsmittel: Guarkernmehl, Stabilisator: Kaliumphosphate, Gewürze, Emulgator: Mono- und Diglyceride der Speisefettsäuren, Knoblauch, Aroma, Säuerungsmittel: Citronensäure Nährwertangaben pro 100 g Pulver: Eiweiß 9,2 g, Kohlenhydrate 40 g, Fett 28 g 100 g/100 g 99,7 g/100 g Tabelle 2: Zugesetzte Mengen allergener Zutaten Zutaten Dotierungsmaterialprobe Probe B Kartoffelmehl 93,6 % 0,26 % Sellerieknollenpulver mg/kg (2,48 %) 68 mg/kg Braunsenfmehl mg/kg (1,97 %) 54 mg/kg Sesampaste (Tahina) Zutaten: Sesamsamen gemahlen Nährwertangaben pro 100g: Eiweiß 26 g, Kohlenhydrate 11 g, Fett 60 g mg/kg (1,62 %) 45 mg/kg Homogenität Die Homogenität der dotierten Probe B wurde mittels ELISA-Tests als 5fach-Bestimmung geprüft (s. Abb. 1) und mit einer Standardabweichung zwischen den Proben von < 15% für das verwendete Verfahren als hinreichend gesichert angesehen (17, 18, 20). Seite 4 von 46

5 Homogenitätsprüfung / Homogeneity Test - ELISA Ergebnisse in % des MW results in % of mean Unabhängige Proben / independat samples, n = 5 Sesam, SD=8,0 Abb. 1: Homogenitätsprüfung der DLA-Probe B Darstellung der Ergebnisse relativ in Prozent des arithmetischen Mittelwerts 2.2 Untersuchung An jedes teilnehmende Institut wurden in der 33. Kalenderwoche 2014 je eine Portion der Untersuchungsmaterialien A und B sowie eine Dotierungsmaterialprobe verschickt. Die Untersuchungsverfahren wurden freigestellt. Die Untersuchungen waren durchzuführen bis spätestens 29. September Ergebnisübermittlung Die Ergebnisabgabe erfolgte einheitlich auf, an die teilnehmenden Institute versandten Übermittlungsbögen bzw. -dateien. Zur Auswertung kamen einerseits die Ergebnisse als positiv/negativ Angaben und andererseits angegebene Gehalte an allergenen Zutaten in mg/kg z.b. als Senf oder Sesam. Abgefragt und dokumentiert wurden die o.g. Ergebnisse sowie Angaben zu den Testmethoden wie Spezifitäten, Testkit-Hersteller und Stichpunkte zur Durchführung der Methoden. Falls Teilnehmer mehrere Ergebnisse für denselben Parameter abgegeben haben, die mit unterschiedlichen Methoden erhalten wurden, wurden diese Ergebnisse mit derselben Auswertenummer mit einem Buchstaben als Suffix unter Angabe der jeweiligen Methode ausgewertet. Alle Teilnehmer haben fristgerecht Ergebnisse abgegeben. Seite 5 von 46

6 3. Auswertung Verschiedene ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln können verschiedene Antikörper-Spezifitäten aufweisen, mit unterschiedlichem Referenzmaterial kalibriert worden sein und sich unterschiedlicher Extraktionsverfahren bedienen. Die verschiedenen ELISA- Methoden können daher zu einer unterschiedlichen Bewertung des Gehalts eines Analyten führen. Aus diesem Grund werden die Ergebnisse, wenn möglich in der Auswertung verschiedenen Bezugswerten gegenübergestellt. Dadurch soll jedes einzelne Ergebnis im Vergleich mit dem Mittelwert aller eingesandten Ergebnisse und/oder im Vergleich mit dem Mittelwert aller Ergebnisse derselben Methode bewertet werden können. Zum Vergleich mit der rechnerisch zugesetzten Menge wurde diese in den graphischen Darstellungen der Ergebnisse mit angegeben. Die ELISA- und PCR-Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. Für die quantitativen Ergebnisse der Dotierungsmaterialprobe und der dotierten Probe wurden anhand der bekannten Zusammensetzung Wiederfindungsraten berechnet und zur Information angegeben. Hierbei erfolgte keine statistische Auswertung. Die angegebenen Wiederfindungsraten dienen ausschließlich einer Einschätzung von Matrixund/oder Prozessierungseinflüssen. 3.1 Bezugswert (zugewiesener Wert) Da es sich bei dem untersuchten Material nicht um zertifiziertes Referenzmaterial handelt wird als Bezugswert (X) für die Auswertung der robuste Mittelwert der eingesandten Ergebnisse verwendet (6). Sofern eine Prüfung der Verteilung der eingesandten Ergebnisse Hinweise für Quellen von höherer Variabilität, wie z.b. eine bimodale Verteilung der Ergebnisse, ergibt, werden zusätzlich als Bezugswerte die robusten Mittelwerte von Einzelmethoden herangezogen. Bei den ELISA-Methoden zur Bestimmung von Allergenen wird, wenn möglich, stets so vorgegangen: i) Robuster Mittelwert aller Ergebnisse - X ALL ii) Robuster Mittelwert von Einzelmethoden - X METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. Einzelergebnisse die außerhalb des angegebenen Messbereiches eines teilnehmenden Labors liegen (z.b. mit der Angabe > 25 mg/kg oder < 2,5 mg/kg) werden für die statistische Auswertung berücksichtigt, sofern eine Angabe mit > oberhalb und eine Angabe mit < unterhalb des Zielbereichs liegt. 3.2 Standardabweichung Zum Vergleich mit der Zielstandardabweichung wird ebenfalls die robuste Seite 6 von 46

7 Standardabweichung (S x ) berechnet (6). Folgende robuste Standardabweichungen werden herangezogen: i) Robuste Standardabweichung aller Ergebnisse - S x ALL ii) Robuste Standardabweichung von Einzelmethoden - S x METHOD i mit mindestens 5 quantitativen Ergebnisangaben. 3.3 Ausreißer Auf Ausreißer wird mittels Mandel s-h-statistik Signifikanz-Niveau 95% geprüft (5). Ermittelte Ausreißer werden informativ genannt sofern gleichzeitig der z-score des Instituts < -2 oder > 2 ist. 3.4 Zielstandardabweichung (für die Eignungsbeurteilung) Die Zielstandardabweichung des Bezugswertes wird nach unten dargestellten, unterschiedlichen Verfahren bestimmt Allgemeines Modell nach Horwitz Die relative Zielstandardabweichung in % des Bezugswertes wird i.d.r. nach folgender Gleichung (Horwitz ) berechnet σ (%) = 2 (1-0,5logX) hieraus wird die Zielstandardabweichung in mg/kg berechnet σ = X * σ (%) / 100. Die Zielstandardabweichung nach Horwitz wird z.z. in der Praxis von ELISA-Verfahren mit Messwerten im mg/kg Bereich nur in Ausnahmefällen erreicht Auswertung eines Versuchs zur Präzision Aus der Vergleichstandardabweichung σ R und der Wiederholstandardabweichung σ r eines Versuchs zur Präzision einer Methode (z.b. aus Ringversuchen nach ASU 64 LFGB) wird die Standardabweichung zwischen Laboratorien σ L berechnet: L = R 2 r 2. Aus den obigen Größen und der Anzahl der Wiederholmessungen n der laufenden Vergleichsuntersuchung wird nun die Zielstandardabweichung berechnet: = L 2 r 2 /n. Da in der vorliegenden Vergleichsuntersuchung die Anzahl der Wiederholmessungen n = 1 ist, ist die Vergleichsstandardabweichung σ R gleich der Zielstandardabweichung σ. Seite 7 von 46

8 Nachstehend sind die relativen Vergleichsstandardabweichungen aus Ringversuchen einiger ELISA-Methoden nach ASU 64 angegeben (13, 14, 15): Methode Parameter Matrix Mittelwerte Relative σ R Literatur ELISA Sojaprotein Brühwurst 0,36-4,07% 14-28% L ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. B) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) ELISA (Herst. A) Erdnuss Erdnuss Erdnuss Haselnuss Haselnuss Vollmilchschokolade Vollmilchschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade Feinherbschokolade 5,9-174 mg/kg 20-31% L ,1-216 mg/kg 14-32% L ,7-148 mg/kg 22-33% L ,6-16,3 mg/kg 12-33% L ,4-21,3 mg/kg 14-19% L Aus den o.g. Präzisionsdaten der ASU 64 Methoden ergeben sich relative Zielstandardabweichungen im Bereich von 12-33%. Das IRMM (Institute for Reference Materials and Measurements) hat in einem Ringversuch die Eignung fünf verschiedener ELISA-Test-Kits zur Bestimmung von Erdnuss getestet (16). Die Mittelwerte lagen im Konzentrationsbereich von 0,3-16,1 mg/kg bzw. 1,2-20,4 mg/kg. Die jeweils niedrigsten relativen Vergleichsstandardabweichungen der fünf Test-Kits lagen für die Matrix Bitterschokolade bei 20-42% und für Kekse bei 23-61% Werte aus Erkenntnissen Die Zielstandardabweichung kann für die Eignungsbeurteilung auf einen Wert festgesetzt werden, der dem Leistungsfähigkeitsniveau entspricht, das der Koordinator für ein wünschenswertes Ziel für die teilnehmenden Laboratorien hält (6). Anforderungen an die Leistungsfähigkeit der Analysenmethoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln mittels ELISA sind u.a. vom Ministry of Health and Welfare (MHLW) in Japan (17), von der Arbeitsgruppe 12 Lebensmittelallergene des Technischen Komitees CEN/TC 275 (18, 19) und von einer internationalen "Food Allergen Working Group" unter der Leitung der AOAC Presidential Task Force on Food Allergens (20) erarbeitet worden. Die hier relevanten ELISA-Validierungskriterien der drei Gremien sind nachstehend angegeben: Literatur (17, 18, 20) Wiederfindungsrate Wiederholstandardabweichung Vergleichsstandardabweichung MHLW % 25% CEN % AOAC % 6,9-34,4% (a) 19,5-57,2 (a) (a) = Beispiel aus hypothetischem Ringversuch im Konzentrationsbereich von 0,5-5 mg/kg Seite 8 von 46

9 Aufgrund der derzeitigen Leistungsfähigkeit von ELISA-Methoden zur quantitativen Bestimmung von Allergenen in Lebensmitteln, die sich aus den Präzisionsdaten von Versuchen und aus den o.g. Validierungsanforderungen ableiten lässt, legen wir für die relative Zielstandardabweichung σ einen Wert von 25% fest. Diese Zielstandardabweichung wurde zur statistischen Bewertung der Ergebnisse mittels z-score herangezogen und auf alle unter 3.1 angegebenen Bezugswerte angewandt. 3.5 z-score Der z-score wird herangezogen zur Beurteilung der Ergebnisse der teilnehmenden Institute. Er besagt um welches Vielfache der Zielstandardabweichung ( σ ) das Ergebnis (x) des betreffenden teilnehmenden Instituts vom Bezugswert (X) abweicht (6). Die Berechnung erfolgt nach z = (x X) / σ ; die Anforderungen an die Analytik gelten im Allgemeinen als erfüllt, wenn -2 z 2. Zur Bewertung wurden nachstehende z-scores mit einer Zielstandardabweichung von 25% in der Auswertung angegeben: i) z-score - z ALL (bezogen auf alle Ergebnisse) ii) z-score - z METHOD i (bezogen auf Einzelmethoden) 3.6 Quotient S x / In Anlehnung an den Horrat-Wert kann die Bewertung einer Laborvergleichsuntersuchung als aussagekräftig gelten, wenn der Quotient von robuster Standardabweichung und Zielstandardabweichung nicht über 2 liegt. Ein über 2 liegender Wert bedeutet, dass die Präzision nicht zufriedenstellend ist, d.h., dass die Präzision aus analytischen Gründen zu variabel ist oder die festgestellte Variation höher ist als für die angewandte Methode geschätzt wurde. Somit ist eine Vergleichbarkeit der Messergebnisse nicht gewährleistet (11). 3.7 Standardunsicherheit Jeder Bezugswert ist mit einer Standardunsicherheit behaftet, die von der Analysenmethode, Unterschieden der eingesetzten Analysenmethoden, dem Probenmaterial und der Anzahl der Teilnehmer (P) einer LVU beeinflußt wird. Die Standardunsicherheit (U x ) wird für die vorliegende LVU wie folgt berechnet (6). u X =1,25 S x / p Seite 9 von 46

10 Ist u X 0,3 muss die Standardunsicherheit des Bezugswertes nicht berücksichtigt werden (6). 3.8 Graphische Darstellung der Bezugswerte Die Bezugswerte werden als farbige Linien in den Abbildungen der Ergebnisse dargestellt. Dies ermöglicht einen optischen Vergleich der Einzelergebnisse mit den verschiedenen Bezugswerten für das Zusatzniveau eines Analyten einerseits und die robusten Mittelwerte über alle Methoden bzw. über Einzelmethoden andererseits. 3.9 Wiederfindungsraten: Dotierung Für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe werden Wiederfindungsraten in Bezug auf die zugesetzten Allergene berechnet. Die Bezugswerte ergeben sich aus den unter 2.1 Untersuchungsmaterial in Tabelle 1 angegebenen Gehalten. Als Akzeptanzbereich AB für die Bewertung der Teilnehmerergebnisse wird der von der AOAC vorgeschlagene Bereich von % für die Wiederfindungsraten von Allergen-ELISAs herangezogen (20). Seite 10 von 46

11 4. Ergebnisse Alle folgenden Tabellen sind anonymisiert. Den teilnehmenden Instituten wird mit dem Versand dieser Auswertung ihre individuelle Auswertenummer mitgeteilt. Die folgenden Ergebnisseiten sind für die allergenen Bestandteile jeweils gleich aufgebaut. Es werden zunächst die Ergebnisse aller Methoden zu einem Parameter für die Probe A und dann für die Probe B angegeben. ELISA-Ergebnisse, die als Senfprotein oder Sesamprotein angegeben wurden, sind in Senf bzw. Sesam, sofern angegeben unter Berücksichtigung der Angaben des betreffenden Testkit-Herstellers, umgerechnet worden. Dabei wurde ein Protein-Gehalt von 26% in Senf und 25% in Sesam zugrunde gelegt. Die Auswertung erfolgte getrennt nach ELISA und PCR-Ergebnissen. Die Ergebnisse wurden nach durchgeführten Methoden zusammengefasst und die Auswertenummern innerhalb der Gruppen aufsteigend sortiert. Die Ergebnisse wurden qualitativ anhand des Prozentsatzes positiver bzw. negativer Ergebnisse bewertet. Sofern 75 % positive oder negative Ergebnisse vorlagen, wurde für die betreffende Probe ein Konsens-Ergebnis (positiv oder negativ) festgestellt. Für jeden Teilnehmer wird in Bezug auf die Konsens-Ergebnisse eine qualitative Bewertung vorgenommen. Hier wurde die Übereinstimmung mit den Konsens-Werten in Prozent angegeben. Gegebenenfalls werden anschließend die Ergebnisse aller Methoden und von Einzelmethoden mit mindestens 5 quantitativen Ergebnissen statistisch ausgewertet. In den Fällen, in denen eine statistische Auswertung der quantitativen Messergebnisse durchgeführt wurde, werden die Ergebnisse tabellarisch folgendermaßen aufgeführt : Ausw ertenummer Ergebnis Ergebnis z-score z-score Methode Hinw eis X ALL X M i pos/neg [mg/kg] X All X Method i Seite 11 von 46

12 Die Kenndaten der jeweiligen Vergleichsuntersuchung werden aufgeführt, falls wenigstens 50% positive Ergebnisangaben und mindestens 5 quantitative Messergebnisse vorliegen: Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode i [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Method i Anzahl der berücksichtigten Messergebnisse Robuster Mittelwert (X) Robuste Standardabweichung (S x ) Median Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) untere Grenze des Zielbereichs (X - 2 σ ) obere Grenze des Zielbereichs (X + 2 σ ) Quotient S x / σ Standardunsicherheit u X Quotient u X / Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Im Anschluss erfolgt die Darstellung der Wiederfindungsraten für die Ergebnisse von Dotierungsmaterialprobe und dotierter Probe. Die Anzahl der Ergebnisse im Akzeptanzbereich von % wird aufsummiert. Seite 12 von 46

13 4.1 Vergleichsuntersuchung Sellerie ELISA-Ergebnisse: Sellerie Anmerkung: Keiner der Teilnehmer hat Sellerie mittels ELISA bestimmt. Seite 13 von 46

14 4.1.2 PCR-Ergebnisse: Sellerie Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 22 negativ negativ - ASU 25 negativ negativ - ASU 26 negativ negativ - ASU 4 negativ < 0,08 positiv 0,2 - BD 31 positiv 0,06 positiv 0,05 - BD 34 negativ negativ - MS 6 negativ <LOD negativ <LOD - PL 1 positiv / positiv / - SFA 9 positiv positiv - SFA 12 positiv > / <LOQ positiv > / <LOQ - SFA 16 negativ negativ - SFA 17 negativ negativ - SFA 19 positiv positiv - SFA 27 negativ 0,4 negativ 0,4 - SFA 28 negativ - negativ - - SFA 3 negativ negativ - div 7 positiv positiv - div 14 negativ negativ - div 18 negativ positiv - div Probe B: Spuren positiv 20 positiv - positiv - - div 21 positiv positiv - div 23 negativ positiv - div 24 negativ negativ - div 29 negativ negativ - div Probe A Probe B Anzahl positiv 8 11 Anzahl negativ Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert kein kein Methoden: ASU = ASU 64 Methode BD = Biotecon Diagnostics MS = All, Microsynth PL = Planton GmbH SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 14 von 46

15 Anmerkung: Zum Nachweis von Sellerie mittels PCR wurden für beide Proben keine Konsenswerte erreicht. Auch in der Dotierungsmaterialprobe waren nur geringe Gehalte an DNA nachweisbar. Aus diesem Grund erfolgte keine qualitative Bewertung der Ergebnisse. Für die quantitative Auswertung lagen zu wenige Ergebnisse vor. Die wenigen vorliegenden Ergebnisse für den Gehalt an Sellerie in der Dotierungsmaterialprobe waren nicht plausibel. Nur 6 von 18 Ergebnissen waren positiv. Kein Teilnehmer hat Gehalte von mehr als 0,4 mg/kg Sellerie bestimmt. Die Ergebnisse sind der Dokumentation zu entnehmen. Das Dotierungsmaterial enthielt ca. 2,5% Sellerieknollenpulver. Das Selleriepulver enthielt 8,4% Protein und einen qualitativ nachgewiesenen Gehalt an Sellerie-spezifischer DNA (PCR / Gelelektrophorese). Das verwendete Selleriepulver wurde im Lebensmittelhandel bezogen. Über den Herstellungsprozess liegen keine Angaben vor. Verarbeitungsprozesse insbesondere Erhitzen und saure ph-werte können zum Abbau von DNA führen und somit die Nachweisbarkeit beeinträchtigen. In der deutschen Methodennorm ASU 64 L wurde ebenfalls für Sellerieknollenpulver eine höhere falsch-negative Rate und eine verminderte Nachweisbarkeit dieses Pflanzenteils beobachtet (22). Dabei lag die Nachweisgrenze bei 50 mg/kg für Sellerieknollenpulver und für Selleriesaat bei 10 mg/kg. Als Ursachen wurden ein geringerer DNA-Gehalt und/oder eine geringere Wirksamkeit der DNA-Extraktion aus dem Sellerieknollenpulver angeführt. Seite 15 von 46

16 4.2 Vergleichsuntersuchung Senf ELISA-Ergebnisse: Senf Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Methoden: Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 3 negativ < 2 positiv 107 2/2 (100%)* AQ Ergebnis umgerechnet 13 negativ < 2 positiv 25,15 2/2 (100%)* AQ 23 negativ positiv 14 2/2 (100%)* AQ 1 negativ < 0,5 positiv > 10 2/2 (100%)* ES 8a negativ < 2,5 positiv 42 2/2 (100%)* ES Ergebnis umgerechnet 11 negativ < 1 positiv 31 2/2 (100%)* ES Ergebnis umgerechnet 14 negativ positiv 43,5 2/2 (100%)* ES Ergebnis umgerechnet 4 negativ < 2 positiv 34,3 2/2 (100%)* IL 9 positiv 1,3 positiv 84,2 2/2 (100%)** RS 10 positiv 1,58 positiv 39,96 2/2 (100%)** RS 15 positiv 0,89 positiv 159,3 2/2 (100%)** RS 22 negativ < 5 positiv 103,3 1/2 (50%)** RS 26 positiv 1 positiv 100 2/2 (100%)** RS 30 positiv 1,32 positiv 143,33 2/2 (100%)** RS 8b negativ < 2,5 positiv 79 2/2 (100%)* VT 12 negativ < LOQ positiv 58 2/2 (100%)* VT 32 negativ < 2,5 positiv 72,5 2/2 (100%)* VT 33 negativ nd positiv 97 2/2 (100%)* VT Probe A Probe B Anzahl positiv 5 18 Anzahl negativ 13 0 Prozent positiv Prozent negativ 72 0 Konsenswert neg / pos positiv * die Ergebnisse ohne Methode RS Konsenswert negativ (s. Anmerkungen) ** die Ergebnisse von RS sind in sich konsistent: Konsenswert positiv (s. Anmerkungen) Übereinstimmungen mit Konsenswerten Ausreißer X Alle AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA-Systems IL = Immunolab RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Senf mittels ELISA zu 72% negative Ergebnisse für Probe A und für Probe B 100% positive Ergebnisse erhalten. Die positiven Ergebnisse für Probe A wurden für die Methode RS angegeben. Innerhalb der Methode RS ergibt sich für Probe A daher ein Konsenswert "positiv". Für alle anderen Methoden ist der Konsenswert Seite 16 von 46

17 "negativ". Die Ergebnisse lagen alle < 5 mg/kg. Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe A Auswertenummer Senf z-score Methode Hinweis X RS [m g/kg] X Methode RS 9 1,3 0,3 RS 10 1,58 1,2 RS 15 0,89-1,1 RS 22 < 5 RS nicht bew ertet ,7 RS 30 1,32 0,3 RS Methoden: RS = Ridascreen, R-Biopharm Seite 17 von 46

18 Kenndaten: Quantitative Auswertung Senf Probe A Kenndaten Bezugswert (X) Methode RS [mg/kg] X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 5 Robuster Mittelwert (X) 1,22 Robuste Standardabweichung (S x ) 0,31 Median 1,30 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 0,31 untere Grenze des Zielbereichs 0,61 obere Grenze des Zielbereichs 1,83 Quotient S x / σ 1,0 Standardunsicherheit u X 0,17 Quotient u X / σ 0,57 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS = R-Biopharm, Ridascreen 5 (100%) Anmerkung: Für Probe A lagen nur positive Ergebnisse von Methode RS vor. Die Auswertung der Ergebnisse zeigte eine geringe Variabilität. Der Quotient S x / σ lag deutlich unter 2,0. Probe A wurde kein Senf als Zutat oder Dotierung zugesetzt. Seite 18 von 46

19 2,0 Probe A: Ergebnisse / Sample A: Results 1,6 mg/kg 1,2 0,8 0,4 0, Auswertenummer / Ev aluation number Abb. 2: ELISA-Ergebnisse Senf Methode RS (Probe A) blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 3,0 Probe A / Sample A z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 3: z-scores Probe A (ELISA-Ergebnisse als Senf) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS (Ridascreen) Seite 19 von 46

20 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Senf z-score z-score Methode Hinweis [mg/kg] X ALL Bezug X ALL X RS X Methode RS ,0 AQ Ergebnis umgerechnet 13 25,15-2,6 AQ ,2 AQ 1 > 10 ES 8a 42-1,6 ES Ergebnis umgerechnet ,2 ES Ergebnis umgerechnet 14 43,5-1,5 ES Ergebnis umgerechnet 4 34,3-2,1 IL 9 84,2 0,8-0,8 RS 10 39,96-1,7-2,5 RS ,3 5,0 2,1 RS ,3 1,8-0,1 RS ,6-0,2 RS ,33 4,1 1,5 RS 8b 79 0,5 VT ,7 VT 32 72,5 0,1 VT ,5 VT Ausreißer X Alle Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA-Systems IL = Immunolab RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Seite 20 von 46

21 Kenndaten: Quantitative Auswertung Senf Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode RS [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode RS Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 17 6 Robuster Mittelwert (X) 70,8 105 Robuste Standardabweichung (S x ) 43,6 48,4 Median 72,5 102 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 17,7 26,3 untere Grenze des Zielbereichs 35,4 52,5 obere Grenze des Zielbereichs Quotient S x / σ 2,5 1,8 Standardunsicherheit u X 13,2 24,7 Quotient u X / σ 0,75 0,94 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: RS = R-Biopharm, Ridascreen 11 (65%) 4 (67%) Anmerkung: Die Auswertung der Ergebnisse aller Methoden zeigte eine leicht erhöhte Variabilität der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ lag über 2,0. Für die Ergebnisse der Methode RS lag der Quotient unter 2,0. Der Mittelwert der Auswertung aller Ergebnisse lag etwa ein Drittel über dem Zusatzniveau, der Mittelwert der Ergebnisse von Methode RS lag etwa doppelt so hoch wie das Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für Senf" S.24). Seite 21 von 46

22 mg/kg > Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results a b Auswertenummer / Ev aluation number Abb. 4: ELISA-Ergebnisse Senf (Probe B) grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS 5,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Alle / Assigned Value: X All 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3,0-4, a b Auswertenummer / Ev aluation number Abb. 5: z-scores Probe B (ELISA-Ergebnisse als Senf) Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse Seite 22 von 46

23 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode RS / Assigned Value Method RS 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 6: z-scores Probe B (ELISA-Ergebnisse als Senf) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode RS (Ridascreen) Seite 23 von 46

24 Wiederfindungsraten für Senf: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis AQ Ergebnis umgerechnet 13-25,15 47 AQ 23 >> BG AQ 1 > 10 > 10 ES 8a ES Ergebnis umgerechnet ES Ergebnis umgerechnet ,5 81 ES Ergebnis umgerechnet ,3 64 IL ,2 156 RS 10 > Std 39,96 74 RS ,3 295 RS ,3 191 RS RS , RS VT ,5 134 VT 33 > VT 8b VT Ausreißer X Alle AB* % AB* % Anzahl im AB 5 Anzahl im AB 8 Prozent im AB 42 Prozent im AB 47 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA-Systems IL = Immunolab RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Anmerkung: 42% der Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Instantsuppen-Pulver-Probe B lagen 47% der Wiederfindungsraten in diesem Akzeptanzbereich. Zu bedenken ist, dass den Probenmaterialien brauner Senf zugesetzt wurde. Seite 24 von 46

25 4.2.2 PCR-Ergebnisse: Senf Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] Übereinstimmungen mit Konsenswerten 21 positiv positiv 2/2 (100%) ASU 29 negativ negativ 0/2 (0%) ASU 6 positiv 2340 positiv /2 (100%) PL 26 negativ negativ 0/2 (0%) QG 1 positiv / positiv / 2/2 (100%) SFA 9 positiv positiv 2/2 (100%) SFA 11 positiv >5 positiv >5 2/2 (100%) SFA 17 positiv positiv 2/2 (100%) SFA 19 positiv positiv 2/2 (100%) SFA 27 positiv 0,4 positiv 0,4 2/2 (100%) SFA 28 positiv - positiv - 2/2 (100%) SFA 32 positiv positiv 2/2 (100%) SFA 7 positiv positiv 2/2 (100%) div 18 positiv positiv 2/2 (100%) div 20 positiv - positiv - 2/2 (100%) div 25 positiv positiv 2/2 (100%) div 29 positiv positiv 2/2 (100%) div 34 positiv 2000 positiv /2 (100%) div Probe A Probe B Anzahl positiv Anzahl negativ 2 2 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert positiv positiv Methoden: ASU = ASU 64 Methode PL = Planton GmbH QG = Qiagen SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Senf mittels PCR wurden in Probe A und Probe B jeweils 89% positive Ergebnisse erhalten. Auch die wenigen quantitativen Ergebnisse lagen in derselben Größenordnung. Die PCR-Ergebnisse stehen nicht in Übereinstimmung mit der Dotierung der Proben. Quantitative Auswertung der Ergebnisse Für die Auswertung lagen zu wenig Ergebnisse vor. Seite 25 von 46

26 Wiederfindungsraten für Senf: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis 21 ASU 29 ASU 6 > NWG PL Ergebnisangabe unklar 26 QG 1 / / SFA 9 SFA 11 >5 >5 SFA 17 SFA 19 SFA 27 0,4 0,4 SFA SFA 32 SFA 7 div 18 div div 25 div 29 div div Angabe als Senf-DNA AB* % AB* % Anzahl im AB 0 Anzahl im AB 0 Prozent im AB 0 Prozent im AB 0 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: ASU = ASU 64 Methode PL = Planton GmbH QG = Qiagen SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Nur zwei Teilnehmer haben quantitative Ergebnisse angegeben. Die Wiederfindungsraten bezüglich des Gehalts als Senf sind nicht plausibel. Es ist nicht klar als was die quantitativen Ergebnisse angegeben wurden (DNA-Kopien, DNA oder Senf in mg/kg). Seite 26 von 46

27 4.3 Vergleichsuntersuchung Sesam ELISA-Ergebnisse: Sesam Qualitative Auswertung der Ergebnisse: Proben A und B Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 3 negativ < 8 positiv 46,4 2/2 (100%) AQ Ergebnis umgerechnet 23 negativ positiv 10 2/2 (100%) AQ 30 negativ < 2 positiv 11,51 2/2 (100%) AQ 32 negativ < 2 positiv 16,6 2/2 (100%) AQ 5 negativ < 6 positiv 270 2/2 (100%) BK 8 negativ < 6 positiv 340 2/2 (100%) BK 12 positiv positiv 1/2 (50%) BK 14 negativ positiv 215 2/2 (100%) BK 1 negativ < 2 positiv 4,8 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet 2 negativ < 2 positiv 5,92 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet 10 negativ < NG positiv 4,52 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet 11 negativ < 2 positiv 5,6 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet 13 negativ < 2 positiv 5,40 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet 33 negativ nd positiv 6,8 2/2 (100%) ES Ergebnis umgerechnet 26 negativ < 0,2 positiv 14 2/2 (100%) NL 35 negativ positiv 17,96 2/2 (100%) NL 15 negativ < 0,24 positiv 134,7 2/2 (100%) RS 22 negativ < 2,5 positiv 235,6 2/2 (100%) RS 24 negativ < 4 positiv 6,4 2/2 (100%) div Ergebnis umgerechnet Probe A Probe B Anzahl positiv 1 19 Anzahl negativ 18 0 Prozent positiv Prozent negativ 95 0 Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA-Systems NL = NutriLinia, Transia RS = Ridascreen, R-Biopharm div = nicht angegeben / andere Methode Anmerkung: Es wurden zum Nachweis von Sesam mittels ELISA 95% negative Ergebnisse für Probe A und für Probe B 100% positive Ergebnisse erhalten. Die Ergebnisse stehen somit in qualitativer Übereinstimmung mit der Dotierung von Probe B. Seite 27 von 46

28 Quantitative Auswertung der Ergebnisse: Probe B Auswertenummer Sesam z-score z-score Methode Hinweis [mg/kg] X ALL Bezug X ALL X ES X Methode ES 3 46,4 AQ Ergebnis umgerechnet AQ 30 11,51 AQ 32 16,6 AQ BK BK 12 BK BK 1 4,8-0,5 ES Ergebnis umgerechnet 2 5,92 0,3 ES Ergebnis umgerechnet 10 4,52-0,7 ES Ergebnis umgerechnet 11 5,6 0,1 ES Ergebnis umgerechnet 13 5,40-0,1 ES Ergebnis umgerechnet 33 6,8 0,9 ES Ergebnis umgerechnet NL 35 17,96 NL ,7 RS ,6 RS 24 6,4 div Ergebnis umgerechnet Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA-Systems NL = NutriLinia, Transia RS = Ridascreen, R-Biopharm div = nicht angegeben / andere Methode Seite 28 von 46

29 Kenndaten: Quantitative Auswertung Sesam Probe B Kenndaten Alle Ergebnisse [mg/kg] Methode ES [mg/kg] Bezugswert (X) X ALL X Methode ES Anzahl der berücksichtigten Meßergebnisse 18 6 Robuster Mittelwert (X) 57,8 5,51 Robuste Standardabweichung (S x ) 87,8 0,926 Median 12,8 5,50 Zielkenndaten: Zielstandardabweichung ( σ ) 1,38 untere Grenze des Zielbereichs 2,76 obere Grenze des Zielbereichs 8,27 Quotient S x / σ 6,1 0,67 Standardunsicherheit u X 0,47 Quotient u X / σ 0,34 Anzahl der Ergebnisse im Zielbereich Methode: ES = ELISA-Systems 6 (100%) Anmerkung: Die Auswertung bezüglich aller Methoden zeigt eine erhöhte Variabilität mit multi-modaler Verteilung der Ergebnisse. Der Quotient S x / σ bei 6,1. Eine Bewertung anhand von z-scores wurde daher nicht durchgeführt. Für Methode ES lag der Quotient S x / σ bei 0,67. Im Zielbereich lagen 100% der Ergebnisse. Der Mittelwert der Auswertung der Methode ES lag etwa um den Faktor 9 niedriger als das Zusatzniveau (s. auch "Wiederfindungsraten für Sesam" S.31). Seite 29 von 46

30 mg/kg Probe B: Ergebnisse / Sample B: Results > > > > Auswertenummer / Ev aluation number Abb. 7: ELISA-Ergebnisse Sesam (Probe B) grüne Linie = Zusatzniveau rote Linie = Bezugswert robuster Mittelwert aller Ergebnisse blaue Linie = Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode ES 3,0 Probe B / Sample B z - Scores Bezugswert: X Methode ES / Assigned Value Method ES 2,0 1,0 0,0-1,0-2,0-3, Auswertenummer / Evaluation number Abb. 8: z-scores Probe B (ELISA-Ergebnisse als Sesam) Bezugswert robuster Mittelwert Ergebnisse Methode ES Seite 30 von 46

31 Wiederfindungsraten für Sesam: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [m g/kg] [%] [m g/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis ,4 103 AQ Ergebnis umgerechnet AQ ,51 26 AQ ,6 37 AQ BK BK 12 > BK BK 10 > Std 4,52 10 ES Ergebnis umgerechnet 1 > 20 4,8 11 ES Ergebnis umgerechnet ,09 5,40 12 ES Ergebnis umgerechnet ,6 12 ES Ergebnis umgerechnet ,92 13 ES Ergebnis umgerechnet 33 > 20 6,8 15 ES Ergebnis umgerechnet NL 35 17,96 40 NL ,7 299 RS ,6 524 RS 24 6,4 14 div Ergebnis umgerechnet AB* % AB* % Anzahl im AB 2 Anzahl im AB 1 Prozent im AB 17 Prozent im AB 6 * Akzeptanzbereich der AOAC f ür Allergen-ELISAs Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA-Systems NL = NutriLinia, Transia RS = Ridascreen, R-Biopharm div = nicht angegeben / andere Methode Anmerkung: 2 Teilnehmer haben in der Dotierungsmaterialprobe mittels ELISA eine Wiederfindungsrate im Bereich der AOAC-Anforderung von % erhalten. Bei der mit dem Dotierungsmaterial hergestellten Instantsuppen-Pulver- Probe B lag eine der Wiederfindungsraten in diesem Akzeptanzbereich. Seite 31 von 46

32 4.2.2 PCR-Ergebnisse: Sesam Auswertenummer Probe A Probe A Probe B Probe B Qualitative Methode Hinweis Bewertung pos/neg [mg/kg] pos/neg [mg/kg] 16 negativ positiv 41 2/2 (100%) MS 34 negativ positiv 30 2/2 (100%) MS als Sesam-DNA 6 negativ <NWG positiv 103 2/2 (100%) PL 1 negativ / positiv / 2/2 (100%) SFA 9 negativ positiv 2/2 (100%) SFA 11 negativ <5 positiv >5 2/2 (100%) SFA 17 negativ positiv 1/2 (50%) SFA 19 negativ positiv 2/2 (100%) SFA 25 negativ positiv 2/2 (100%) SFA 27 negativ 0,4 positiv 0,4 2/2 (100%) SFA 28 negativ - positiv 13,7 2/2 (100%) SFA 32 negativ < 1 positiv 5,8 2/2 (100%) SFA 7 negativ positiv 2/2 (100%) div 8 negativ positiv 2/2 (100%) div 18 negativ positiv 2/2 (100%) div 20 negativ - positiv - 2/2 (100%) div 21 negativ positiv 2/2 (100%) div 22 negativ positiv 2/2 (100%) div 26 negativ positiv 2/2 (100%) div Probe A Probe B Anzahl positiv 0 19 Anzahl negativ 19 0 Prozent positiv Prozent negativ Konsenswert negativ positiv Übereinstimmungen mit Konsenswerten Methoden: MS = All, Microsynth PL = Planton GmbH SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Zum Nachweis von Sesam mittels PCR wurden in Probe A und Probe B jeweils 100% negative bzw. positive Ergebnisse erhalten. Die PCR-Ergebnisse stehen somit in Übereinstimmung mit der Dotierung der Probe B. Quantitative Auswertung der Ergebnisse Für die Auswertung lagen zu wenige Ergebnisse vor (Teilnehmer 34 hat das Ergebnis als DNA angegeben). Seite 32 von 46

33 Wiederfindungsraten für Sesam: Dotierungsmaterialprobe und Probe B [mg/kg] [%] [mg/kg] [%] Auswertenummer Dotierungsmaterial Wiederfindungsrate Probe B Wiederfindungsrate Methode Hinweis MS MS als Sesam-DNA 6 >NWG PL 1 / / SFA 9 SFA 11 >5 >5 SFA als Sesam-DNA 17 SFA 19 SFA 25 SFA 27 0,4 0,4 SFA als Sesam-DNA 28-13,7 30 SFA ,8 13 SFA 7 div 8 div 18 div div 21 div 22 div 26 div AB* % AB* % Anzahl im AB 2 Anzahl im AB 2 Prozent im AB 67 Prozent im AB 40 * Akzeptanzbereich der AOAC für Allergen-ELISAs Methoden: MS = All, Microsynth PL = Planton GmbH SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Anmerkung: Nur fünf Teilnehmer haben quantitative Ergebnisse angegeben. Da bei Teilnehmer 34 nicht klar ist als was die quantitativen Ergebnisse angegeben wurden (DNA-Kopien, DNA oder Sesam in mg/kg), sind die angegebenen Wiederfindungsraten ggf. nicht zutreffend (sie wurden auf mg Sesam/kg). Seite 33 von 46

34 5. Dokumentation Angaben der Teilnehmer 5.1 ELISA: Sellerie keine Angaben 5.2 ELISA: Senf Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 3 negativ < 2 positiv 27,9 positiv Protein AQ AgraQuant Mustard AgraQuant F.A.S.T. Mustard 13 negativ < 2 positiv 25, Senf AQ (COKAL2148F), RomerLabs 23 negativ positiv 14 positiv >> BG Senf AQ AgraQuant, RomerLabs ELISA-Systems, Mustard Seed 1 negativ < 0.5ppm positiv > 10ppm positiv > 10ppm Senf ES Protein Residue (ESMUS-48) ELISA-Systems, Mustard Seed 8a negativ < 2,5 positiv 11 positiv 3800 Senfprotein ES Protein Residue (ESMUS-48) ELISA-Systems, Mustard Seed 11 negativ < 1 positiv 8 positiv 2000 Senfprotein ES Protein Residue (ESMUS-48) Elisa Systems Mustard seed 14 negativ Senfprotein ES residue MUS < 2-34, Senf IL Immunolab Senf ELISA Ridascreen Fast Senf / Mustard 9 positiv 1,3 positiv 84,2 positiv Angabe als Senf/Senfpulver RS (R6152), r-biopharm Ridascreen Fast Senf / Mustard 10-1,58-39,96 - > Std Senf RS (R6152), r-biopharm Ridascreen Fast Senf / Mustard 15 positiv 0,89 positiv 159,3 positiv Senf RS (R6152), r-biopharm 22 negativ < 5 positiv 103,3 positiv Senfpulver RS Ridascreen Fast Senf Ridascreen Fast Senf / Mustard Senf RS (R6152), r-biopharm Ridascreen Fast Senf / Mustard 30 positiv 1,32 positiv 143,33 positiv Senf RS (R6152), r-biopharm Veratox Mustard Allergen, 8b negativ < 2,5 positiv 79 positiv Senf VT Neogen Veratox Mustard Allergen, 12 negativ < BG positiv 58 positiv Senf VT Neogen Veratox Mustard Allergen, 32 negativ < 2,5 positiv 72,5 positiv Angabe als VT Neogen Veratox Mustard Allergen, 33 negativ nd positiv 97 positiv > 25 Senf VT Neogen Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs ES = ELISA-Systems IL = Immunolab RS = Ridascreen, R-Biopharm VT = Veratox, Neogen Seite 34 von 46

35 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. 3 AQ Spezifität Antikörper Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 13 AQ - 23 AQ gem. Hersteller 1 ES 8a ES nach Herstellerangaben 11 ES Sonstige Hinweise ungeeignete Dotierungsproben für die Analyse aller Analyten 1g Probe und 10 ml Extraktionspuffer. 60 C für ES polyklonal Probe B scheint nicht vollständig homogen min. 4 IL gegen Senfprotein 9 RS 10 RS k.a. Dotierungsprobe wurde bis 1:200 verdünnt Probe A: 1,63; 1,65; 1,46 Probe B: 39,90; 40,02 15 RS Senfprotein wässrige Extraktion (Puffer), 10 min 60 C In Probe A, sowie in Probe B waren bis zu 22 RS gelber, weißer, brauner und schwarzer Senf lt. Kit-beschreibung kirschkerngroße grüne Stücke enthalten, daher ist die Homogenität der Materialien wahrscheinlich nicht gegeben. 26 RS spezifischer Antikörper gegen alle Senf-Arten nach Testanleitung 30 RS Senf (gelb, weiß, braun, schwarz) nach Testkitanleitung Ergebnisse für Probe C erforderten hohe Verdünnungen, daher nur als Abschätzungen angegeben 8b VT nach Herstellerangaben 12 VT Senf nach Herstellerangaben 32 VT lt. Manual: Abweichung 1g Einwaage 33 VT Extraktion: 60 C vorgewärmter TRIS-EDTA / 15 min bei 60 C in Schüttelwasserbad / zentrifugieren, Bestimmung: 4 Parameterkurve Seite 35 von 46

36 5.3 ELISA: Sesam Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Angabe quantitatives Meth. Methode Dotierungsprobe Ergebnis als Abk. qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg qualitativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 3 negativ <2 positiv 11,6 positiv Protein AQ AgraQuant Sesame 23 negativ positiv 10 positiv 180 Sesam AQ AgraQuant, RomerLabs 30 negativ <2 positiv 11,51 positiv Sesam AQ AgraQuant Sesame (COKAL1948), RomerLabs 32 negativ < 2 positiv 16,6 positiv Sesam AQ AgraQuant Sesame (COKAL1948), RomerLabs 5 negativ <6 positiv 270 positiv Angabe als BK BioKits, Sesame Assay Kit (902070X), Neogen 8 negativ <6 positiv 340 positiv Sesam BK BioKits, Sesame Assay Kit (902070X), Neogen 12 positiv positiv positiv > Sesam BK BioKits, Sesame Assay Kit (902070X), Neogen 14 negativ Sesam BK Neogen biokits Sesame Assay kit ELISA-Systems, 1 negativ <0.5ppm positiv 1.2ppm positiv >5ppm Sesamprotein ES Sesamsamenprotein Residue (ESSESRD-48) 2 negativ <0.5 positiv 1,48 positiv 691 Sesamsamenprotein ES 10 - <NG - 1,13 - > Std Sesamprotein ES 11 negativ <0,5 positiv 1,4 positiv 530 Sesamprotein ES 13 negativ < 0.5 positiv 1,35 positiv 3,8 Sesamprotein ES 33 negativ nd positiv 1,7 positiv >5.0 Sesamsamenprotein ES ELISA-Systems, Sesamsamenprotein Residue (ESSESRD-48) ELISA-Systems, Sesamsamenprotein Residue (ESSESRD-48) ELISA-Systems, Sesamsamenprotein Residue (ESSESRD-48) ELISA-Systems, Sesamsamenprotein Residue (ESSESRD-48) ELISA-Systems, Sesamsamenprotein Residue (ESSESRD-48) 26 - < 0, Sesam NL nutrilinia Sesam-E (NC-6005), Transia 35 negativ positiv 17,96 positiv Sesam NL Transia Sesam E 15 negativ < 0,24 positiv 134,7 positiv Sesam RS RIDASCREEN FAST Sesam 22 negativ <2,5 positiv 235,6 positiv Sesam RS Ridascreen Fast Sesam 24 negativ <1,0-1,6 - Sesamprotein div Auswahl Sesam-Kits: Methoden: AQ = AgraQuant, RomerLabs BK = BioKits, Neogen ES = ELISA-Systems NL = NutriLinia, Transia RS = Ridascreen, R-Biopharm div = nicht angegeben / andere Methode Seite 36 von 46

37 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Antikörper z.b. Extraktionslösung / Zeit / Temperatur 3 AQ 23 AQ gem. Hersteller >BG Sonstige Hinweise 30 AQ Sesamprotein nach Testkitanleitung Ergebnisse für Probe C erforderten hohe Verdünnungen, daher nur als Abschätzungen angegeben 32 AQ lt. Manual 5 BK 8 BK nach Herstellerangaben 12 BK Sesam nach Testanleitung 14 BK polyklonal 1 ES 2 ES 10 ES spezifischer anti-sesamsamen 2S-Albumin Ak Dotierungsprobe wurde bis 1:100 verdünnt Probe B: 1,14; 1,12; 1,14 11 ES 13 ES ES anti-sesamsamen 2S Albumin Antikörper High salt Tris Extraktionspuffer, 1g Probe + 5 ml vorgewärmter Puffer, 2 min RT. Dotierungsmaterialprobe, Verdünnung 1:1000 ergab als Ergebnis 0.691mg/kg, folglich als Endergebnis 691mg/kg. Höhere Verdünnungen ergaben alle Ergebnisse <0.5mg/kg Extraktion: PBS / 15 min bei 60 C in Schüttelwasserbad / zentrifugieren, Bestimmung: 4 Parameterkurve 26 NL gegen Sesam-proteine gerichteter AK nach Testanleitung 35 NL poly 15 RS Sesamprotein wässrige Extraktion (Puffer), 10 min 60 C 22 RS Sesamprotein lt. Kit-beschreibung siehe oben 24 div Seite 37 von 46

38 5.4 PCR: Sellerie Primärdaten Auswertenummer Ergebnis Probe A Ergebnis Probe B Ergebnis Dotierungsprobe Angabe quantitatives Meth. Methode Ergebnis als Abk. positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg positiv / negativ mg/kg z.b. Lebensmittel / Protein Test-Kit + Anbieter 22 negativ negativ negativ Sellerie-DNA ASU ASU 64 L negativ negativ negativ Sellerie-DNA ASU ASU 64 L xQuantiFast Pathogen PCR Fa.Qiagen 26 negativ negativ - Sellerie ASU Primer/Sonde:eurofins /mwg/operon. Amtliche Sammlung nach 64 LFGB 4 negativ <0,08 positiv 0,2 positiv 0,1 Sellerie BD Biotecon Diagnostics GmbH 31 positiv 0,06 positiv 0,05 positiv 0,11 Sellerie BD foodproof Celery Detection Kit 34 negativ negativ negativ Sellerie-DNA MS Köppel et al (AllAll C, D) 6 negativ <NWG negativ <NWG negativ <LOD Angabe als PL PLANTON GmbH; pmapiummat3 1 positiv / positiv / positiv / Sellerie-DNA SFA Sure Food Allergen, Congen / r-biopharm SureFood Allergen 9 positiv positiv positiv Angabe als Sellerie SFA Celery (S3105), r- Biopharm 12 positiv >NWG, <BG positiv >NWG, <BG - Sellerie-DNA SFA Congen Surefood Allergen Quant Celery Surefood Allergen 16 negativ negativ negativ Sellerie SFA QUANT Celery, Congen (via r- biopharm) 17 negativ negativ negativ Angabe als SFA Sure Food Allergen Celery, Congen 19 positiv positiv - Angabe als SFA r-biopharm SureFood ALLERGEN 27 negativ 0,4 negativ 0,4 negativ 0,4 Sellerie DNA SFA Celery, CONGEN S3105 S3401 SureFood ALLERGEN 4plex Soya/Celery/Mustard+I 28 negativ - negativ Angabe als SFA ACS3401 SureFood ALLERGEN 4plex Soya/Celery/Mustard+I AC 3 negativ negativ negativ DNA div Hausverfahren 7 positiv positiv positiv Angabe als div andere: Hausverfahren QB-RT negativ negativ negativ Sellerie-DNA div In house 18 negativ Spuren positiv negativ Sellerie-DNA div Primer/Sonden TIB Molbiol 20 positiv - positiv - negativ - Sellerie div other: CEN/TS : positiv positiv positiv Sellerie-DNA div Hausverfahren 23 negativ positiv - Sellerie div Köppel et al. 2012, Eugster negativ negativ - Sellerie-DNA div 29 negativ negativ negativ Angabe als div Hausverfahren Methoden: ASU = ASU 64 Methode BD = Biotecon Diagnostics MS = All, Microsynth PL = Planton GmbH SFA = Sure Food Allergen, R-Biopharm / Congen div = keine genaue Angabe / andere Methode Seite 38 von 46

39 Weitere Angaben zu den Methoden Auswertenummer Meth. Abk. Spezifität Target-Sequenz / -DNA z.b. Extraktion / Enzyme / Clean-Up / Real Time PCR / Gelelektrophorese / Cyclen Extraktion: CTAB basiertes Extrationsverfahren mit 22 ASU Mannitoldehydrogenase (101 bp) anschließender Aufreinigung über Wizard-Kit der Fa. Promega; Real-time PCR: 45 Zyklen 25 ASU Mannitol-Dehydrogenase CTAB Präzipitation, QIAgen PCR Purification Kit, Real Time PCR 26 ASU Protein der Mannitoldehydrogenase Dneasy R mericon Food Kit/ Proteinase K/ Real Time PCR/ 45 Zyklen 4 BD Real Time PCR, foodproof DNA Extraktion 31 BD 34 MS Mannitol Dehydrogenase Gen Wizard Extraktion / Rotorgene / 45 Zyklen Sonstige Hinweise 6 PL s.sop PLANTON GmbH; CTAB; Magnetic Beads 1 SFA Extraktion mit interner Methode / real time PCR 9 SFA SureFood Prep Allergen (S1012), r-biopharm 12 SFA Sellerie Real time PCR 16 SFA Sellerie-DNA nach Herstellerangaben, 45 Zyklen 2 Analysen 17 SFA Real Time, 35 Zyklen 19 SFA Real Time PCR 27 SFA foodproof Magnetic Preparation Kit III, BIOTECON S40013L Nachweisgrenze 1 mg/kg; DNA-Extraktion mit S1012 SureFood PREP 28 SFA - AllergenNachweisgrenze 1 mg/kg; - DNA-Extraktion mit S1012 SureFood PREP Allergen 3 div 7 div Phenol-Chloroform-Extraktion 14 div Mannitol-dehydrogenase-Gen Hinweise zur Methode (Extraktion und Bestimmung) Säulenbasiert/foodproof Sample Preparation Kit III / 200mg Einwaage / Real-time PCR (LC 480-II) Extraktion mit Dneasy Blood&Tissue kit, Qiagen. Real time PCR mit Sonde, 45 Zyklen 18 div Sellerie-Manitoldehydrogenase Gens Real Time PCR Ct-Wert 38,5 Quanifizierung mittels Allergen RM 800 (Biotecon Diagnostics); Keine Inhibition in der internen Kontrolle zu beobachten. In Probe A & B wurde 7000 mg/kg Rinder-DNA gemessen, Dotierungsprobe negativ NWG 0,4 ppm, DNA-Extraktion Sure Food Prep PlantX 20 div Mannitol Dehydrogenase AF67082 Extraktion: Biotecon GMO Probenvorbereitungs- Kit+alpha-Amylase, +RNAase, Real-time PCR: Taqman, FAM-TAMRA, 45 Zyklen, Referencgen: Actin 21 div DNA Extraktion mit MN Food Kit, RealTimePCR 45 Cycles 23 div Mannitoldehydrogenase Gen gem. SLMB resp. Lit. 24 div 29 div Seite 39 von 46