BMBF-Projekt AllerGen: DNA-Nachweis soll vor versteckten Allergenen in Lebensmitteln schützen

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1 Powered by Seiten-Adresse: BMBF-Projekt AllerGen: DNA-Nachweis soll vor versteckten Allergenen in Lebensmitteln schützen Nahrungsmittelallergien sind Überempfindlichkeits reaktionen betroffener Personen gegen ansonsten harmlose Lebensmittel und deren Bestandteile. Für sensibilisierte Personen kann bereits der Verzehr sehr geringer Mengen an Allergie-auslösenden Lebensmitteln eine unmittelbare Gesundheitsgefährdung darstellen. Obwohl sich viele Betroffene ihrer Allergie bewusst sind, erleiden sie nachweislich allergische Reaktionen, da das auslösende Lebensmittel für sie nicht immer erkennbar in Nahrungsmitteln vorhanden ist. Der zuverlässige, sensitive und quantitative Nachweis geringster Mengen allergener Nahrungsmittel bestandteile ist daher in den vergangenen Jahren stärker in den Fokus gerückt. In einem vom BMBF geförderten Projekt befassen sich Prof. Dr. Jörg Bergemann und sein Team an der Hochschule Albstadt-Sigmaringen gemeinsam mit Partnern aus Lebensmittel überwachung, Wissenschaft und Industrie mit innovativen Ansätzen zur Analytik und Vermeidung allergener Kreuzkontaminationen in der Gewürzverarbeitung. Im Mittelpunkt des Projekts steht die Entwicklung sensitiver und quantitativer Verfahren zum Nachweis von allergenen Nahrungsmittel bestandteilen, die Überprüfung und Bewertung bereits bestehender Methoden sowie die Aufdeckung und Vermeidung von Kreuzkontaminationen in den kooperierenden Betrieben. Klinisch manifestierte Nahrungsmittelallergien lassen sich bei 1 bis 3 Prozent der Erwachsenen identifizieren [1]. Unter Kindern und Jugendlichen sind weit höhere Prozentzahlen vorzufinden. Neueste Zahlen aus den USA belegen, dass dort bereits 8 % der Kinder und Jugendlichen unter einer Nahrungsmittelallergie leiden. 38,7 % davon berichteten über schwere Reaktionen und 30,4 % davon wiesen sogar Allergien gegen mehrere Nahrungsmittelbestandsteile auf [2]. Dabei sind Nahrungsmittelbestandteile, die Allergien auslösen können, keineswegs Produkte etwa aus einer Chemie-Giftküche, sondern ganz normale Nahrungsmittel wie Nüsse, Milch, Soja, Sellerie, Senf. Überempfindlichkeits reaktionen von Betroffenen gehen auf das Hervorrufen einer fehlerhaften Antwort des körpereigenen Immunsystems gegen bestimmte Glyko- Proteine in Nahrungsmitteln zurück. Bereits geringste Mengen eines allergenen Lebensmittels können schwere allergische Reaktionen bewirken, die im schlimmsten Fall auch tödlich verlaufen. Bei der Herstellung industriell erzeugter Nahrungsmittel können allergene Nahrungsmittel bestandteile unbeabsichtigt oder technisch unvermeidbar in ein Lebensmittel gelangen, 1

2 Für die Standardisierung, Bewertung und Optimierung der Allergenanalytik ist die Herstellung von Vergleichsmaterial auf Gewürzbasis mit einer homogenen Verteilung der allergenen Rohstoffe erforderlich. Die Herausforderung besteht im homogenen Einbringen geringster Mengen an Allergen z. B. 1, 5, 10 mg in die Lebensmittelmatrix Gewürz sowie dem anschließenden sensitiven Nachweis. Marion Kenk/Silvia Panter, HS Albstadt-Sigmaringen beispielsweise bei der Nutzung gemeinsamer Produktionslinien für allergenhaltige und allergenfreie Produkte. Man spricht dabei von Kreuzkontaminationen. Da diese nicht unter die Kennzeichnungs verordnung fallen, sichern sich die Hersteller im Sinne der Produkthaftung zunehmend mit der Kennzeichnung kann Spuren von enthalten ab. Die inzwischen teils extensive Verwendung dieser Spurenkennzeichnungen schränkt jedoch zunehmend das Angebot an Lebensmitteln für Allergiker ein. Dringend erforderlich ist die baldige Einführung von gesetzlich festgelegten Grenzwerten, die helfen sollen, schwere Reaktionen bei Allergikern zu vermeiden. Zur Kontrolle zukünftiger Grenzwerte ist eine abgesicherte und zuverlässige Analytik jedoch unerlässliche Grundvoraussetzung. Dem Projekt liegen drei Schwerpunkte zugrunde. Neben der gewürz spezifischen Bewertung bereits verfügbarer Allergen analytik arbeiten wir an der Entwicklung sensitiver Polymerase- Kreuzkontaminationen mit potentiell allergenen Bestandteilen sind vor allem im Bereich der Gewürz verarbeitung zu einem wichtigen Thema geworden. Hier werden viele hundert Einzelsubstanzen und Gemische und praktisch fast alle kennzeichnungs pflichtigen Allergene, häufig unter Staubentwicklung und in den gleichen Anlagen gehandhabt. Zum Nachweis von unter anderem versteckten Allergenen beschäftigt sich die Arbeitsgruppe AllerGen an der Hochschule Albstadt-Sigmaringen im Rahmen eines vom Bundesministerium für Bildung und Forschung geförderten Projekts mit dem Aufbau einer sensitiven, quantitativen und zuverlässigen Analytik zum Nachweis genomischer und extra chromosomaler DNA allergener Nahrungsmittel bestandteile in Gewürzen. Standardisierung, Überprüfung und Optimierung der Allergenanalytik 2

3 Ketten reaktionen in Echtzeit mit neuartigen DNA-Targets, aber auch an der Entwicklung quantitativer Methoden. Zu Projektbeginn gab es noch wenige bis keine Erkenntnisse über die Eignung der bestehenden Nachweis verfahren in der Lebens mittel matrix Gewürz. Verstärkt wurde die Problematik durch das Fehlen von geeignetem Vergleichs material, erklärt Prof. Dr. Jörg Bergemann. Vergleichs materialien werden zur Standardisierung der Allergen-Analytik, zur Überprüfung und Bewertung von analytischen Methoden sowie zur Entwicklung quantitativer Methoden benötigt. Hierzu wurde im Rahmen des Projekts Vergleichs material auf Gewürzbasis hergestellt, welches neun allergene Nahrungsmittel bestandteile in definierten Konzentra tionen beinhaltet. Bei diesem Projekt wurde ein 'allergen freies' Modell gewürz mit definierten Mengen an Allergen (10000, 1000, 100, 50, 20, 10, 5, 1 mg/kg) versetzt und homogen gemischt, berichtet Jörg Bergemann. Dieses Vergleichs material wurde auch schon zur matrix abhängigen Quantifizierung von authentischen Gewürz proben eingesetzt. Untersucht wurde dabei die Anwesenheit von Soja, Sellerie und Senf. Kontaminationen mit Senf und Sellerie konnten in mehr als 50 % der untersuchten Proben nachgewiesen werden. Dies zeigt deutlich die Relevanz des Forschungs projekts. Teilweise lagen diese Kontami nationen auch weit über dem Spurenbereich. Bei der Auswertung wurden zum Beispiel Werte im Bereich von 100 bis 1000 ppm beobachtet. Dadurch ergibt sich eine potentielle Gefahr für betroffene Allergiker. Effiziente DNA-Isolierung ist Voraussetzung für eine zuverlässige Real-time PCR Analytik Anhand des etablierten Vergleichs materials konnte bei den klassischen Verfahren zur DNA- Isolierung (Isolierung der Gesamt- DNA) gezeigt werden, dass diese teils sehr unterschiedlich für Gewürze geeignet sind. Eine effiziente DNA-Isolierung ist jedoch Grund voraussetzung für eine zuverlässige Analytik mittels Real-time PCR ( PCR: Polymerase-Kettenreaktion), so dass wir diese optimieren wollten, um ein großes Spektrum an Lebens mittel matrices abzu decken und verschiedenste Produkt gruppen testen zu können, bemerkt Jörg Bergemann. Unter die Lupe genommen haben die Sigmaringer Wissenschaftler dabei auch ein modulares System, bestehend aus einer DNA-Isolierung mittels Magnetic Capture Hybridisierung (MCH) und anschließender Real-time PCR. Bei der MCH erfolgt eine sequenz spezifische Isolierung des Ziel analyten mittels streptavidinbe schichteter Magnet partikel und biotynilierter Fänger sonden. Die MCH dient zur Eliminierung von möglichen PCR- Inhibitoren, Hintergrund- DNA und Begleit stoffen wie z. B. Fette, Proteine und Poly saccharide, fasst Jörg Bergemann zusammen. Diese Methode ist bisher noch nicht in der Lebens mittel analytik eingesetzt worden. Die Sigmaringer Forscher konnten jedoch am Beispiel von Hasel nuss bereits ein MCH-System zur sequenz spezifischen Isolierung etablieren. Eine Publikation zu diesem Thema wurde eingereicht. Neuer Ansatz mit hoher Sensitivität Eine weitere analytische Methode, mit der sich das AllerGen-Team befasst, ist ein Nachweis system unter Nutzung von mito chondrialer DNA (mtdna). Die Vorteile dieser Vorgehens weise liegen unter anderem darin, dass mtdna in Zellen in höherer Kopien zahl vorliegt als nukleäre 3

4 DNA. Durch die höhere Ausgangs kopienzahl wird theoretisch ein sensitiverer Nachweis erwartet. Mitochondriale DNA liegt in höherer Kopienzahl vor als nukleäre DNA. Aufgrund der höheren Ausgangskopienzahl wird bei der Real-time-PCR-Analyse eine Sensitivitätssteigerung erwartet. Tobias Bauer, HS Albstadt-Sigmaringen [3] Als nachzuweisendes Allergen wurde Soja gewählt. Hierzu wurde ein sonden basiertes Realtime-PCR-System zum Nachweis des atpa-gens der mitochondrialen DNA von Soja etabliert. Wir erzielen mit diesem System eine fast 100-fach höhere Sensitivität im Vergleich zu einem kommerziellen Soja nachweis system und können damit den Spuren bereich nun viel genauer erfassen, nennt Jörg Bergemann die Vorzüge der mitochondrialen Nachweis methode. Dies erlaubt zum Beispiel in verarbeitenden Betrieben Kreuz kontaminationen nachzuweisen und entsprechende Maßnahmen zur Minimierung oder im besten Fall zur vollständigen Vermeidung einzuleiten. Mit Hilfe dieses Systems konnten im Projektverlauf bereits bestehende Reinigungs prozesse bei den Projektpartnern überprüft werden. Standardgerade für mitochondriale DNA (durchgezogene Linie) und nukleäre DNA (gestrichelte Linie). Aufgetragen wurden die resultierenden CT-Werte gegen die Menge an eingesetzter Gesamt-DNA. Die durchschnittliche CT-Wert Differenz zwischen mitochondrialer und nukleärer DNA beträgt 7,63 ±0,12 (n=6), wodurch sich eine fast 100-fache Steigerung der Sensitivität ergibt. Das nukleäre System detektierte eine minimale Menge von 25 pg Gesamt-DNA, das mitochondriale System konnte die minimale Menge von nur 0,25 pg Gesamt-DNA zuverlässig nachweisen. Die Steigerung der Sensitivität unter Verwendung von mitochondrialer DNA konnte somit bestätigt werden. Tobias Bauer, HS Albstadt-Sigmaringen [3] Das atpa-real-time-pcr-system zum sensitiven Nachweis von Soja wurde im Rahmen einer Veröffentlichung beim J AOAC Int. akzeptiert und wird im Herbst 2011 in diesem Journal veröffentlicht werden [3]. Gemeinschaftsprojekt der Wissenschaft und Industrie Das AllerGen-Projekt wird vom BMBF für drei Jahre unterstützt. Partner der Hochschule 4

5 Albstadt-Sigmaringen sind unter anderem die Hochschule Ostwestfalen-Lippe, das Chemische und Veterinäruntersuchungsamt Sigmaringen sowie die Firmen Spices and More GmbH (Stockstadt), CONGEN Biotechnologie GmbH (Berlin), Rubinmühle GmbH (Lahr), Schumann & Sohn GmbH (Karlsruhe) und Metro Group Buying International/Real (Düsseldorf). Die Relevanz dieses Projektes wird durch aktuelle Arbeiten der Hochschule Albstadt-Sigmaringen unterstrichen, die zeigen, dass bei über 50 Prozent der untersuchten Handelsproben Allergene als Kreuzkontamination nachgewiesen werden konnten (unveröffentlichte Arbeiten). Die Projektpartner aus Forschung, Lebensmittelindustrie und Lebensmittelüberwachung haben sich daher zum Ziel gesetzt, Verbesserungen für betroffene Verbraucher zu ermöglichen. Fachbeitrag Michael Statnik BioLAGO BIOPRO Baden-Württemberg GmbH Weitere Informationen Quellen:[1] Scientific Panel of Dietetic Products, Nutrition and Allergies (2004), The EFSA Journal 32:1-197 [2] The Prevalence, Severity, and Distribution of Childhood Food Allergy in the United States Ruchi S. Gupta, Elizabeth E. Springston, Manoj R. Warrier, Bridget Smith, Rajesh Kumar, Jacqueline Pongracic, and Jane L. Holl; Pediatrics Jul;128(1):e9-17. Epub 2011 Jun 20. [3] Sensitive Detection of Soy (Glycine max) by Real-time Polymerase Chain Reaction Targeting the Mitochondrial atpa Gene; Bauer, Kirschbaum, Panter, Kenk, Bergemann; J AOAC Int, 2011, ahead of printn:prof. Dr. Jörg Bergemann Hochschule Albstadt-Sigmaringen, Biomedical Engineering Anton-Günter-Straße Sigmaringen Tel.: +49 (0) Fax: +49 (0) bergemann(at)hs-albsig.de Hochschule Albstadt-Sigmaringen, Biomedical Engineering Der Fachbeitrag ist Teil folgender Dossiers Volksseuche Allergie 5