Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Allergene in Lebensmitteln Molekulare Nachweissysteme in der Allergen-Diagnostik

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1 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Allergene in Lebensmitteln Molekulare Nachweissysteme in der Allergen-Diagnostik Ulrich Busch

2 Unser Profil: Das LGL ist die zentrale Fachbehörde des Freistaats Bayern für Lebensmittelsicherheit Gesundheit Veterinärmedizin Arbeitsschutz/Produktsicherheit Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 2

3 Unsere Ziele: Wir haben uns zum Ziel gesetzt, gesundheitliche Risiken für die Bevölkerung vorausschauend zu erfassen, zu bewerten und zu bewältigen die Bevölkerung zu eigenverantwortlichem gesundheitsbewussten Verhalten zu motivieren die Verbraucherinnen und Verbraucher aktiv und schnell zu informieren und vor Irreführung und Täuschung zu schützen als Mittler zwischen Theorie und Praxis zu fungieren, Dienstleister für die amtliche Lebensmittelüberwachung, den öffentlichen Gesundheitsdienst, das amtliche Veterinärwesen und die Arbeitsschutzverwaltung in Bayern zu sein Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 3

4 Unsere Standorte Dienststelle Würzburg Dienstsitz Erlangen Dienststelle Oberschleißheim mit Dienstgebäude München Pfarrstraße Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 4

5 Hintergrund u. U. erhebliche Gesundheitsgefährdung bereits durch geringste Mengen der allergenen Zutat insbesondere Gefahr durch versteckte Allergene, d.h. nicht deklarierte oder unbeabsichtigt eingetragene Komponenten Verbesserte Kennzeichnungsvorschriften für allergene Zutaten durch die EU Bedarf an Nachweismethoden im Spurenbereich Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 5

6 Häufigkeit und Verbreitung von Allergien Big Eight : Erdnuss, Milch, Baumnüsse, Krebstiere, Fisch, Eier, Soja und Weizen Für > 90% der Lebensmittelallergien in den USA verantwortlich häufigste Auslöser von Lebensmittelallergien weltweit Häufigkeit von Lebensmittel-Allergien in EU: 1-3 % der Erwachsenen und 4-6 % bei Kindern und Jugendlichen 20 %-30 % geben an, an LM-Allergien zu leiden Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 6

7 DBPCFC-Studien niedrigste Allergie-auslösende Menge Allergenes LM Minimale Menge Referenz Erdnuss g Hourihane et al Haselnuss g Wensing, 2002 Sellerie < 0.7 g Ballmer-Weber et al., 2000 Karotte < 1.2 g Ballmer-Weber et al., 2001 Fisch g Taylor et al., 2002 Eier g Nørgaard & Bindslev-Jensen, 1992 Milch 0.5 ml Taylor et al., 2002 Garnele 16 g Daul et al., 1988 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 7

8 Umgang mit Lebensmittel-Allergien Keine echte Heilung bei Lebensmittelallergien möglich Hypoallergene Nahrung Hyposensensibilisierung Meiden! daher Information unabdingbar Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 8

9 Rechtsgrundlagen zur neuen Allergenkennzeichnung Richtlinie 2003/89/EG vom 10. November 2003 Einführung der zwingenden Kennzeichnung allergener Zutaten Richtlinie 2005/26/EG vom 21. März 2005 vorläufige Ausnahmen von der Kennzeichnungspflicht Richtlinie 2005/63/EG vom 3.Oktober 2005 Berichtigung der Richtlinie 2005/26/EG Richtlinie 2006/142/EG vom 22. Dezember 2006 Aufnahme von Lupine und Weichtiere Nationale Umsetzung durch 3., 5. und 6. Änderung der LMKV Anwendung ab dem 25. November 2005 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 9

10 Allergieauslösende Zutaten nach Anhang IIIa RL 2003/89/EG Glutenhaltiges Getreide (Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Dinkel, Kamut oder Hybridstämme daraus) und daraus hergestellte Erzeugnisse Krebstiere und Krebserzeugnisse Eier und Eiererzeugnisse Fisch und Fischerzeugnisse Erdnüsse und Erdnusserzeugnisse Soja und Sojaerzeugnisse Milch und Milcherzeugnisse Schalenfrüchte (Mandel, Haselnuss, Walnuss, Cashewnuss, Pecannuss, Paranuss, Pistazie, Macadamia- und Queenslandnuss) Sellerie und Sellerieerzeugnisse Senf und Senferzeugnisse Sesamsamen und Sesamsamenerzeugnisse Schwefeldioxid und Sulfite >10 mg/kg (SO 2 ) Lupine Weichtiere Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 10

11 Zusammenfassung Allergene Zutaten sind immer anzugeben EGAL: Es gilt Allergene Labeln (P. Loosen BLL) Keine Ausnahmen (außer wenn Verkehrsbezeichnung auf allergenes Potential hinweist (Eierlikör) Keine Kennzeichnungserleichterungen Mehrfachnennungen (Fußnote mit * nach Kommissionsleitlinien zur Anwendung der neuen Vorschriften) Auch wenn kein allergenes Potential vorhanden ist Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 11

12 Offene Fragen Kennzeichnung loser Ware Kennzeichnung von Kontaminationen Einführung eines Schwellenwerts Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 12

13 Nachweismethoden in der Allergen-Analytik Anforderungen: Hohe Spezifität Hohe Sensitivität (Nachweisgrenze 1 ppm wünschenswert) Nachweis auch in prozessierten Lebensmitteln möglich Anwendung in vielen unterschiedlichen Lebensmittelmatrices Routinefähigkeit immunchemisch molekularbiologisch ELISA Nachweis allergener Proteine oder Markerproteine für die Spezies PCR Nachweis speziesspezifischer DNA- Sequenzen Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 13

14 PCR Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 14

15 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 15 Fond der chemischen

16 Bestätigungsreaktionen Restriktionsendonukleasen Southernblothybridisierung Sequenzierung Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 16

17 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 17

18 M M M ACC I Hae III Nsi I M Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 18

19 Real Time PCR Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 19

20 Was ist FRET? Sonde1 Donor FRET steht für Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer. Sonde2 Akzeptor Ein Donor-Fluorophor wird mit der Lichtquelle des Gerätes angeregt, überträgt die Energie auf ein anderes Fluorophor. Das andere Fluorophor kann das Licht aufnehmen und wieder abstrahlen (Akzeptor), was vom Gerät gemessen wird. Donor und Akzeptor müssen zueinander passen und nah beieinander liegen. Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 20

22 Hydrolyse Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 22

23 In jedem Zyklus entsteht ein Fluoreszenzsignal für jedes neu entstandene PCR-Produkt... Zunahme der Fluoreszenz... Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 23

25 Bestätigung mit LightCycler stx-1 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 25

26 Allergen-Nachweis auf DNA-Ebene DNA-Extraktion Amplifizierung charakteristischer Zielsequenz Konventionelle PCR Detektion Verifizierung Bildch en Real-Time PCR* *Detektion, Verifizierung all inclusive Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 26

27 Nachweisverfahren für Sellerie Großer Bedarf an Nachweismethode vorhanden, da - Sellerie, eines der häufigsten Allergene bei Erwachsenen ist - Sellerie in einer Vielzahl an Lebensmittelprodukten vorkommt Literatur: - ein Sellerie-spezifisches System, aber konventionelle PCR - ein Real-time PCR-System, jedoch mit Kreuzreaktionen Kein ELISA-Nachweis für Sellerie vorhanden Entwicklung eines spezifischen Real-time PCR-Systems Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 27

28 Entwicklung des Primer-Sonden-Systems TaqMan TM -Sonde Primer 1 FAM 101 bp TAMRA Primer 2 Mannitoldehydrogenase-Gen des Sellerie Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 28

29 Spezifität Prüfung auf Kreuzreaktionen gegenüber > 50 pflanzlichen und tierischen Organismen Apiaceen Anis, Dill, Fenchel, Karotte, Koriander, Kreuzkümmel, Kümmel, Liebstöckel, Pastinake, Petersilie, Pimpinelle Häufig mit verwendete Lebensmittelzutaten, z. B. Hefe, Huhn, Kartoffel, Lauch, Lorbeer, Rind, Tomate, Zwiebel Ergebnis: alle PCR-Nachweise negativ 0 % Falsch-Positiv Rate Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 29

30 Herstellung von dotierten Brühwürsten kein zertifiziertes Referenzmaterial verfügbar Herstellung von Brühwürsten mit Sellerie-Anteilen von ppm ausgehend von 1 g Selleriesaat auf 1 kg Brät, stufenweise Verdünnung bis 1 ppm Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 30

31 Untersuchung von Handelsprodukten - Schwerpunktprogramm Gewürze Suppenpasten Trockensuppen Soßenpulver Probenverteilung nach Produktgruppen Gewürzpräparate Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 31

32 Untersuchungsschema Homogenisieren DNA-Extraktion Extrakt 1 Extrakt 2 PCR: 1) Extrakte unverdünnt 2) Extrakte 1:10 verdünnt 3) Extrakte Kopien Spike-DNA Bewertung: positiv, negativ, in Spuren Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 32

33 Ergebnisse des Schwerpunktprogramms 12 Produkte mit deklarierter Selleriezutat: 10 x Sellerie nachgewiesen 2 x falsch negativ (Gewürzextrakte) 19 Produkte ohne Angabe von Sellerie: 8 x kein Sellerie detektiert, 7 x Sellerie nachgewiesen 4 x Sellerie in Spuren 4 Produkte mit kann Sellerie enthalten : 3 x Sellerie nachgewiesen 1 x Sellerie in Spuren? Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 33

34 Bewertung bei positivem Sellerie-Nachweis Kontamination oder Zutat? Schwellenwert + quantitativer Nachweis Schweiz seit 1999: 1g/kg Untersuchung einer Nachprobe ggf. Betriebskontrollen zumutbare Maßnahmen zur Vermeidung/ Minimierung von Kontaminationen getroffen? Einsicht in Rezepturen, Lieferpapiere Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 34

35 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit Nachweis allergener Zutaten in Lebensmitteln mittels ligationsabhängier PCR (LPA)

36 Methode: Ligationsabhängige PCR (LPA) 5 PBS 3 spacer OH P PBS 3 5 Target DNA Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 36

37 LPA: Ligation 5 3 OH P PBS 3 5 Target A PBS 5 3 PBS Produkt A PBS 5 5 PBS OH P 3 5 Target B PBS 3 DNA Ligase 5 PBS Produkt B PBS 3 PBS OH P 3 5 Target C PBS 3 5 PBS Produkt C PBS 3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 37

38 LPA: Amplifizierung 5 3 PBS Produkt A PBS 5 PBS Produkt B PBS 3 5 PBS Produkt C PBS 3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 38

39 LPA: Amplifizierung Produkt A Produkt B PBS PBS PBS Produkt C PBS PBS 3 PBS DNA Polymerase 3 FAM 3 FAM 5 3 Produkt A Produkt B FAM 5 3 Produkt C 5 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 39

40 LPA: Detektion * * Produkt A * 5 3 * * Produkt B * * * Produkt C * 5 3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 40

41 LPA: Detektion * Produkt A * * 5 * * 3 Produkt B * 5 3 Kapillarelektrophorese relative fluorescence Product C Product B Product A * Produkt C time * * 5 3 Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 41

42 Zusammenfassung Entwicklung eines spezifischen und sensitiven Nachweis für verschiedene Baumnüsse, Erdnuss und Sesam Die Methode erlaubt die parallele Detektion aller 10 Targets in einem Reaktionsansatz. Die Nachweisgrenze für einzelne Allergene in verschiedenen Matrices (Schokolade, Keks, Pesto) wurde mit 5 mg/kg bestimmt. Untersuchung von Handelsproben zeigt bisher ausschließlich im Zutatenverzeichnis bzw. in den freiwilligen Angaben im Rahmen der Produkthaftungspflicht deklarierte Bestandteile. Flexibilität des modularen Systems hinsichtlich Einbindung weiterer Targets Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 42

43 Danksagung Dr. Christine Hupfer Alexandra Ehlert (GALAB Hamburg) Anja Demel Michaela Bunge Elisabeth Haggerty Institut für Hygiene und Technologie der Lebensmittel tierischen Ursprungs der Ludwig-Maximilian Universität München Dieses Projekt wird gefördert aus Mitteln des Bayerischen Staatsministeriums für Umwelt, Gesundheit und Verbraucherschutz Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit 43