MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen. Modul 2 BLAST-Sequenzsuche und Sequenzvergleiche

Transkript

1 MOL.504 Analyse von DNA- und Proteinsequenzen Modul 2 BLAST-Sequenzsuche und Sequenzvergleiche

2 Summary Modul 1 - Datenbanken Wo finde ich die DNA Sequenz meines Zielgens? Wie erhalte ich Info aus der DNA-Datenbank Information über die tatäschlich kodierende Sequenz? Welches Format hat eine FASTA Sequenz? Wo finde ich Proteinsequenzen meines Zielproteins? Wie kann ich das Molekulargewicht, aufgeschlüsselte AS- Zusammensetzung, isoelektrischen Punkt, Extinktionskoeffizent meiner Proteinsequenz bestimmen? Wie erhalte ich Information über PTMs, z. B. potentielle Phosphorylierungssstellen, Glykosilierungsstellen? Was bedeutet das ProSite consensus Pattern einer N-Glykosilierungsstelle N-{P}-[ST]-{P} Welche Proteine können mit BRENDA gefunden werden, welche nicht?

3 Inhaltsübersicht Theorie des Sequenz-Alignment Homologie & Evolution Dotplot Scoring-Matrizen (PAM, BLOSUM) Alignment-Algorithmen (FASTA, BLAST) Anwendung in Programmen & Datenbanken BLAST (via NCBI) Clustal-W2, Clustal-O Other alignment programs

4 Die Begriffe Sequenz-Alignment und -vergleich Das Alignment ist das Ausrichten (zweier) Sequenzen mit dem Ziel, eine höchstmögliche Ähnlichkeit zu finden anschaulich durch Verschieben der Sequenzen gegeneinander Referenz Referenz AGCGATTCCATCGCATATG ATTCCATCGCATATGCAGT AGCGATTCCATCGCATATG ATTCCATCGCATATGCAGT Der finale Sequenzvergleich bewertet die Ähnlichkeit zwischen (zwei) bestmöglich ausgerichteten Sequenzen basierend auf den Ähnlichkeits-Scores aller korrespondierenden Positionen, also einzelner Nukleotid- bzw. AS-Rest-Paare entweder global für die kompletten Sequenzen oder lokal für bestimmte Bereiche

5 Bedeutung des Sequenzvergleichs Rückschlüsse auf Struktur und Funktion von Sequenzen Annahme: die Funktion liegt in der Struktur und die Struktur in der Sequenz begründet Sequenz-Konservierung Struktur-Konservierung Funktions-Konservierung Rückschlüsse auf evolutionäre Beziehungen evolutionärer Abstand, Grad der Verwandtschaft, gemeinsame Vorfahren,

6 Homologie Ähnlichkeit (similarity) gegen Homologie (homology) Sequenzähnlichkeit ist ein mathematisches Konzept, welches im Alignment und Ähnlichkeits-Scoring seinen Ausdruck findet Homologie ist ein evolutionäres Konzept: 2 Sequenzen A und B sind homolog, wenn A eine Mutation von B ist, oder wenn A und B von einem gemeinsamen Sequenz-Vorfahren abstammen Hohe Ähnlichkeit weist auf Homologie hin, jedoch bleibt dies stets eine Annahme (die man mit einer Wahrscheinlichkeit belegen kann) Es muss immer überprüft werden, ob die Annahme der Homologie biologisch sinnvoll ist!

7 Orthologie und Paralogie Sequenz-Homologe können in zwei Typen unterteilt werden Orthologie beschreibt homologe Gene in verschiedenen Spezies, von einem gemeinsamen Vorfahren abstammend. Orthologe haben meist die selbe Funktion (jedoch nicht zwingenderweise) Paralogie bezeichnet homologe Gene innerhalb einer Spezies, welche sich durch Gen-Duplikation getrennt entwickelt haben, und meist die selbe Funktion besitzen (auch hier nicht zwangsläufig)

8 Sequenzalignment Voraussetzungen für das Alignment ein Modell bzw. Verfahren zum Bewerten von Übereinstimmungen und Abweichungen für jedes mögliche Paar zweier Sequenzelemente ( Buchstaben ) ein Score für die (negative) Bewertung von Insertions/Deletions Gap Penalty eine Methode, um den Gesamt-Score zu optimieren eine Methode, um die Signifikanz des Alignment zu bewerten

9 Die Dotplot-Methode Eine 2D-Matrix ermöglicht den paarweisen Sequenzvergleich Alle Bausteine der einen Sequenz in Spalten (A i ) Alle Bausteine der zweiten Sequenz in Zeilen (B j ) Die Matrix-Zellen M ij bezeichnen den Vergleich jedes A i mit jedem B j A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 A N B 1 M 11 M 21 M N1 B 2 M 12 M 22 B N M 1N M NN

10 Die Dotplot-Methode Suche nach identischen Sequenzelementen Alle Kombinationen von Positionen in A und B, an denen die Bausteine von identischem Typ sind, werden markiert

11 Die Dotplot-Methode Identifizierung zusammenhängender Abschnitte Die Matrix wird von oben links in Richtung unten rechts analysiert zunächst sind multiple Lösungen erlaubt (verschiedene Startpunkte)

12 Die Dotplot-Methode Optimierung durch Reduktion auf den längstmöglichen Pfad Verknüpfung bestehender zusammenhängender Abschnitte Lücken sind erlaubt, Rückschritte (nach links oder oben) verboten Insertion / Deletion konservierte Bereiche

13 Die Dotplot-Methode Dotplot einer repetitiven Sequenz (ABRACADABRACADABRA) Dotplot einer palindromischen Sequenz (MAX I STAY AWAY AT SIX AM)

14 Die Dotplot-Methode Beispiel für einen realen Dotplot konservierte Bereiche Insertion / Deletion

15 Scoring-Matrizen dienen zur Bewertung der Übereinstimmung zweier beliebiger Sequenzelemente z. B.: Vergleich zweier Aminosäurereste an einer gegebenen Position des Alignments vor dem Alignment ist dies jede Zelle einer Dotplot-Matrix während des Alignments sind dies die Zellen entlang der zu optimierenden Pfade als Ergebnis des Alignments sind dies die korrespondierenden (im Idealfall identischen) Aminosäurereste des längsten Pfades Paare sowohl identischer als auch nicht-identischer Aminosäurereste sollen bewertet werden ein scoring scheme muss Substitutionen, Insertionen und Deletionen berücksichtigen

16 Scoring-Matrizen PAM-250 (20% Sequenzübereinstimmung) und BLOSUM-62 sind zwei der gebräuchlichsten Matrizen für Aminosäuren gegeben sind Scores für die zufällige Substitution einer AS gegen eine andere je ähnlicher die AS in ihren Eigenschaften sind, desto positiver der Score identische AS haben i. a. die höchsten Scores Die Werte variieren auch für identische Paare: seltene AS wie TRP und CYS haben die höchsten Scores

17 Wahl von Scoring-Matrizen PAM (Point Accepted Mutation) gegen BLOSUM (BLOcks SUbstitution Matrix) heutezutage haben BLOSUM-Matrizen die PAM-Matrizen als Default in Alignment-Programmen bzw. -Servern verdrängt jedoch gibt es noch kein BLOSUM-Äquivalent zu PAM für bestimmte Vergleiche kurzer Sequenzen Abhängigkeit vom Zweck des Alignments keine einzelne Matrix ist die alleingültige Lösung für alle Arten von Sequenzvergleichen je größer der BLOSUM-Wert und kleiner der PAM-Wert, desto geeigneter sind diese Matrizen für das Alignment sehr ähnlicher Sequenzen bzw. hochkonservierter Bereiche PAM-120 und BLOSUM-62 sind geeignet für mäßig abweichende Sequenzen, können jedoch außerhalb ihres Leistungsfensters versagen am zweckmäßigsten für universell einsetzbare Alignment-Programme (und in der Tat gegenwärtige Praxis) ist die die Kombination verschiedener Scoring-Systeme

18 Alignment-Algorithmen Zusammengesetzte Algorithmen bedienen sich verschiedener Methoden für die Schritte eines Alignments z. B. Dotplot zur Optimierung der Alignment-Länge z. B. PAM/BLOSUM für das Scoring von AS-Übereinstimmungen Bewertung von Insertionen/Deletionen ( Lückengewichtung ; gap-penalty) Dynamic programming -Algorithmen im Fall paarweiser Alignments bzw. für eine geringe Zahl von Sequenzen sind jedoch sehr zeitaufwändig, da zumindest mit n * m skaliert FASTA und BLAST verwenden schnellere Algorithmen für die Suche in Datenbanken es werden zunächst in einer schnellen Suche nur Teilstücke von Sequenzen verglichen erst für eine kleine Auswahl der am besten passenden Sequenzen wird ein aufwändiges Komplett-Alignment berechnet

19 Der FASTA-Algorithmus Ein 4-Schritt-Prozess

20 BLAST Basic Local Alignment Search Tool BLAST ist ein Paket von Programmen zur Ähnlichkeitssuche in verschiedenen Sequenz-Datenbanken (sowohl für Polynukleotide als auch Proteine) der zugrundeliegende Algorithmus ist geschwindigkeitsoptimiert (daher muss eine gewisse Sensitivitäts-Einbuße beim Erkennen entfernt verwandter Sequenzen in Kauf genommen werden) im Kern basiert BLAST auf lokalem Alignment, daher können Sequenzen, welche (nur) isoliert-konservierte Bereiche gemeinsam haben, (dennoch) als verwandt erkannt werden BLAST-Scores haben eine genau definierte statistische Interpretation (E- Wert), so dass signifikante, also echte, Treffer gut von Zufallstreffern unterschieden werden können

21 BLAST

22 BLAST-Varianten blastp vergleicht eine AS-Eingabesequenz (AS-Query) gegen eine Protein-DB blastn vergleicht eine Nukleotid-Query gegen eine Polynukleotid-DB blastx vergleicht die Translationsprodukte einer Nukleotid-Query (6-Frame; beide Stränge im Fall von DNA) gegen eine Protein-DB tblastn vergleicht eine AS-Query gegen die dynamisch erzeugten Translationsprodukte einer Polynukleotid-DB tblastx vergleicht die Translationsprodukte einer Nukleotid-Query gegen die dynamisch erzeugten Translationsprodukte einer Polynukleotid-DB

23 BLAST-Eingabe Vgl. Übung Datenbanken: Blastn für Bacillus subtilis, Gen yqjm Zugang über den Nucleotide-Eintrag

24 BLAST-Eingabe BLAST-Eingabeformular

25 BLAST-Ergebnisseite Graphischer Überblick zeigt Länge der Übereinstimmungen an (ggf. mit Gaps) Balken sind Links auf das jeweilige Alignment selber zeigt Ähnlichkeits-Score (S) farblich an

26

27 BLAST-Ergebnisseite Auflistung der Treffer Accession-Nummern, Scores, E-Werte, Länge der Übereinstimmung, Identität Sortiert nach Max score (S-Wert) Query coverage beachten im Vergleich zu Max. Ident. E-value Links Klick auf Accession-Nummer führt zum Nukleotide-Eintrag Klick auf Max Score führt zum Alignment

28 BLAST-Ergebnisseite

29 Kriterien für BLAST-Treffer: E-values, Score S-Werte (Scores) BLAST-Scores (S-Werte) sind die Summe der einzelnen Ähnlichkeits- Scores an jeder Position des Alignements, einschließlich der Gap Penalties im Falle von Aminosäure-Alignments wird die jeweils gewählte AS- Scoring-Matrix herangezogen (z. B. BLOSUM-62) Je höher der S-Wert, desto ähnlicher ist eine in der DB gefundene Sequenz zur Eingabesequenz (Query) E-Werte BLAST Expect values (E-Werte) geben die Wahrscheinlichkeit an, das gefundene Alignment bei Annahme zufälliger Treffer in einer DB der vorliegenden Größe zu erhalten je kleiner der E-Wert, desto geringer die Zufälligkeit, desto größer die Signifikanz des Treffers E-Werte sind aber tendenziell umso größer, je kleiner die Sequenzlänge und je größer die DB ist (im Fall einer sehr großen DB und gleichzeitig sehr kurzer Sequenzen können selbst hohe S-Werte zufällig sein)

30 BLAST-Ergebnisseite detaillierte Auflistung der Alignments komplette ausgerichtete Sequenzen (Query & Subject), übereinander normalerweise mehrere Zeilen-Blöcke à 60 Buchstaben senkrechte Verbindung zeigt Identität an Download button FASTA format für ausgerichteten Sequenzteil!

31 BLAST-Ergebnisseite Download button FASTA format für ausgerichteten Sequenzteil (als *.txt Datei)!

32 Clustal-Omega HMM profile-profile techniques to generate alignments Sequenzalignment 3 oder mehrerer gegebenen Sequenzen (DNA, Protein) Vergleich zweier Sequenzen z.b.: