Von der LC-MS/MS zur automatisierten online-spe-lc-ms/ms - Beispiel antiretrovirale Pharmaka -
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- Peter Hochberg
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1 Medizinische Hochschule Hannover Institut für Pharmakologie Carl-Neuberg-Str. 1 D Hannover koal.therese@mh-hannover.de Von der LC-MS/MS zur automatisierten online-spe-lc-ms/ms - Beispiel antiretrovirale Pharmaka - Therese Koal Emile Koster Michal Svoboda Volkhard Kaever 1
2 HIV/AIDS ca Millionen HIV-infizierte Menschen weltweit 2005: 5 Mio Neuinfektionen; 3 Mio Tote North America 1.2 Mio Western / Central Europe Eastern Europe / Central Asia 1.6 Mio Caribbean North Africa / Middle East East / South Asia 8.2 Mio Latin America 1.8 Mio Sub-Sahara 25.8 Mio Oceania Daten: 2UNAID
3 Behandlung: HAART - bei zu niedrigen Spiegeln: Resistenzentwicklung - bei zu hohen Spiegeln: vermehrte UAW PD-TDM: PK-TDM: Viruslast / CD4 pos. Zellen Virusmenge / Immunabwehr Zielspiegel in Plasma mit LC-MS/MS UAW / Resistenzentwicklung 3
4 Antiretrovirale Pharmaka I HAART mit Kombination von. Protease-Inhibitoren (PI) LC-API-MS/MS. Nicht-Nukleosidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (NNRTI) LC-API-MS/MS. Nukleosidische/Nukleotidische reverse Transkriptase-Inhibitoren (N(t)RTI) Keine Korrelation von Plasmaspiegel & antiretroviralem Effekt da Prodrugs Messung intrazellulärer phosphorylierter Metabolite notwendig 4
5 Quantitative Analytik Probenvorbereitung: Proteinfällung 1. LC-MS/MS 8 min/probe 2. Online SPE-LC-MS/MS automatische XLC einfache C18 HD Symbiosis Säulenschaltung Pharma (Spark OASIS Holland) HLB 35 min/probe 5
6 Quantitative Analytik Simultane Analyse 6
7 Chromatographie Probenvorbereitung Proteinfällung PI (7) NNRTI (2) LC-MS/MS Intensity, cps X (OASIS)- LC-MS/MS X (C18HD)- LC-MS/MS Symbiosis Pharma 1,70 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 7
8 Carry over-effekte hohe Therapie-Zielspiegel hohe Konzentrationen (bis ng/ml!) Oasis HLB-SPE 1 Säule/1000 Analysen Symbiosis (C18HD)-SPE 1 Kartusche/1-30 Analysen Intensity, cps MeOH Blank nach 800 MeOH Blank nach Messung c= ng/ml 650 Messung c= ng/ml Carry over: < 0.5%! Carry over: 0.08 %! 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 Intensity, cps ,27 0,53 0,70 0,77 1,65 0,19 0,24 1,75 2,89 0,37 1,47 2,012,04 2,20 2,50 2,57 2,74 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 8
9 Matrixeffekte - Post Column Infusion Plasma nach Proteinfällung 3.6e5 2.8e5 LC-MS/MS 2.0e5 1.2e5 6.0e Intensity, cps 2.0e5 1.6e5 1.2e5 8.0e4 4.0e4 OASIS XLC-MS/MS e5 1.8e5 1.0e5 2.0e4 Symbiosis XLC-MS/MS
10 Matrixeffekte - Signal Response (Bsp. Amprenavir) 120 LC-MS/MS relative Peakarea % Plasma relative Peakarea OASIS XLC-MS/MS Symbiosis XLC-MS/MS 87% % relative Peakarea Plasma Plasma Plasma nach Proteinfällung 10
11 Matrixeffekte - MS/MS Selektivität LC-MS/MS OASIS XLC-MS/MS Symbiosis XLC-MS/MS Intensity, cps 8.0e4 6.0e4 4.0e4 2.0e4 MRM 6.0e4 4.0e4 2.0e4 MRM 6.0e4 4.0e4 2.0e4 MRM Intensity, cps 4.0e5 3.0e5 2.0e5 1.0e5 SIM 2.8e5 2.0e5 1.0e5 SIM 3.0e5 2.0e5 1.0e5 SIM Plasma nach Proteinfällung 11
12 Probenvorbereitung Proteinfällung von Patienten-Plasma (offline) Alternativen Dried Blood Spots (whole blood) (Koal et al., RCM 2005; 19: ) Direkt in Plasma: mit Verdünnung ohne Verdünnung 12
13 Direkt in Plasma: Mit Verdünnung (Koal et al., submitted) Plasmaverdünnung 1:8 Matrixverdünnung & IS-Zugabe Methodenvergleich n=50 Patienten Protein fällung (Standard ) Konzentration in ng/ml y = 0,9743x + 36,6 R 2 = 0, Dilute & Inject Konzentration in ng/ml 13
14 Direkt in Plasma: Ohne Verdünnung Probleme: Matrixbestandteile & Zugabe des IS Lösungsansatz: Symbiosis Pharma System mit modifizierter Software Plasma - Probe & Vial für IS Autosampler: 1. Plasma 2. IS Injektion auf SPE-Kartusche 14
15 Résumé XLC-MS/MS - kurze Analysenzeiten (2 Proben simultan) - effiziente Eliminierung: Matrix-, Carry-over-Effekte - ähnliches Methoden set-up für versch. Applikationen - einfache Integration neuer Pharmaka in die Methode Vereinfachung der Probenvorbereitung - Analyse von verdünnten Plasmaproben - direkte Analyse von Plasmaproben 15
16 Annette Garbe Annette Linck Christa Urban Ina Hackbarth NIH Aids Reagent Reference Program XLC: MS/MS: Spark Holland Applied Biosystems 16
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