Zielgerichtetes amplikonbasiertes Sequenzieren bei Chronisch Lymphatischer Leukämie
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- Bella Friedrich
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1 Zielgerichtetes amplikonbasiertes Sequenzieren bei Chronisch Lymphatischer Leukämie
2 1. CLL Chronisch Lymphatische Leukämie Anreicherung von langlebigen monoklonalen reifen B-Zellen Häufigste Leukämie in der Westlichen Welt Heterogene klinische Verläufe Gesamtüberlebensraten zwischen 2 bis 15 Jahre nach Diagnose Nicht heilbar Page 2
3 Chronisch lymphatische Leukämie, 4.Auflage UNI_MED 1. CLL Prognostische Faktoren IgHV U-CLL: schlechte Prognose L M-CLL: gute Prognose J ZAP70 Überexpression korreliert mit U-CLL >20% ZAP-70 + CLL Zellen = schlechte Prognose CD38 Überexpression korreliert mit U-CLL Chromosomale Auffälligkeiten (del11q, del17p, del13q, Trisomie 12) Page 3
4 2. CLL Panel Zielgene Jeromin S. et al., Leukemia 2014 Rossi D. et al., Blood 2013 Fabbri G. et al., JEM 2011 Puente X.S. et al., Nature 2011 Wang L. et al., NEJM, 2011 Quesada V. et al., Nat Genet, 2011 Page 4
5 2. CLL Panel Proben 136 CLL Proben aus der CLL/GCLLSG Biobank - IGHV Status - ZAP70, CD38 Expressions-Status - FISH/SNP Genotypisierung - Immunophenotypisierung - Klinische Annotation Klinische Daten Behandelt/ Unbehandelt 41 (30%) / 94 (70%) Geschlecht (männlich / weiblich) 70% / 30% Median Alter 63 (Range: 29-86) Binet Stage (A / B / C) A: 54% / B: 22% / C: 18% / 6% n.k. Median WBC (x1000/µl) 49 (Range: ) Page 5
6 2. CLL Panel MiSeq Sequenzierung Anreicherung der Zielregionen mittels Multiplex PCR Automatisierte Probenvorbereitung Poster SA-078 AmpliSeq (Life Technologies) Sensitivitätstestung mit mutierter Zelllinien DNA - Mino TP53 mutiert - AT45RM mit ATM mutiert NEXTflex Illumina Adapter (Bioo Scientific) Auswertung - Interne NGS Pipeline - Integrative Genomics Viewer Validierung von 54 Varianten mittels Sanger Sequenzierung Page 6
7 3. Ergebnisse Sensitivität TP53 c.440t>g; p.v147g ATM c.7792c>t; p.r2598* Nachweis der Sensitivität von mind. 5% für MiSeq Sequenzierung Page 7
8 3. Ergebnisse Mutationsanalyse > Variants Entfernen aller Varianten <5% Allelfrequenz Entfernen synonymer Varianten Entfernen von SNPs und Artefakten <1% 173 Varianten in 86/136 Proben Page 8
9 3. Ergebnisse Mutationsanalyse TP53 Mutationsstatus: Unbehandelte Patientengruppe (n=95) Behandelte Patientengruppe (n=41) 12% 33% Page 9
10 3. Ergebnisse Mutationsanalyse Signifikante Korrelation zwischen NOTCH1 Mutationsstatus und klinischen Parametern in der unbehandelten Patientengruppe (n=94) 63% 57% 44% 33% Page 10
11 3. Ergebnisse Mutationsanalyse SF3B1 Mutationen vor allem in Exonen assoziiert mit schlechter Prognose Mutationen führen zu verkürzten und fehlerhaft gespleißten Proteinen, z.b. FOXP1 Page 11
12 White Blood Count [10E9/L] 3. Ergebnisse Mutationsanalyse Hoch signifikante Korrelation zwischen XPO1 Mutationsstatus und IGHV Mutationsstatus, sowie WBC in der unbehandelten Patientengruppe (n=94) p=0,00117 Page 12
13 4. Zusammenfassung 1) Automatisierte NGS Analyse in 3 Tagen 2) Gute Kenntnis des Panels für eine exakte Auswertung 3) Mutationen NOTCH1 Mutationen in PEST Domäne TP53 Mutationsstatus korreliert mit Behandlungsstatus SF3B1 Mutationen die mit schneller Progression und kürzerem Überleben der Patienten assoziiert wurden Hoch signifikante Korrelationen zwischen XPO1 Status und IGHV Status, sowie WBC Page 13
14 Danksagungen Uniklinik Köln Institut für Pathologie Reinhard Büttner Margarete Odenthal Ulrike Koitzsch Katharina König Lukas Heukamp Innere Medizin I Carmen Schweighofer Christian Reinhardt Laura Wilden Cologne Center of Genomics Martin Peifer Uniklinik Essen Institut für Pathologie Fabian Mairinger Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Page 14
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