Leukämie- und Lymphomdiagnostik

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1 Leukämie- und Lymphomdiagnostik Jour Fixe I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie 1

2 Pfeiler der Diagnostik Klinik Laborbefunde I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen Leuko: 56000/µl HK: 38% Thrombo: /µl LDH: 311 U/l (-240) γ-glob.: 5.5g/l (6.6-) β2-mikro: 3.0mg/l (-2.7) II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl LDH: 424 U/l (-240) III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. 2

3 Pfeiler der Diagnostik Klinik Laborbefunde Morphologie Der Blutausstrich/Spin Spin pro und kontra: Kontra: Kaum Kernschatten, Blasten nicht konzentriert, Verlust von Blasten? Haarzellen schwieriger zu erkennen? Pro: Für Differentialblutzählung optimal gleichmäßige Verteilung, Chromatindichte reproduzierbarer 3

4 Klassische Befunde Peripheres Blut 1 Klassische Befunde Peripheres Blut 1 4

5 Klassische Befunde Peripheres Blut 1 Klassische Befunde Peripheres Blut 2 5

6 Klassische Befunde Peripheres Blut 2 Klassische Befunde Peripheres Blut 2 6

7 Klassische Befunde Peripheres Blut 2 Klassische Befunde Peripheres Blut 3 7

8 Klassische Befunde Peripheres Blut 3 Klassische Befunde Peripheres Blut 3 8

9 Klassische Befunde Peripheres Blut 4 Klassische Befunde Peripheres Blut 4 9

10 Klassische Befunde Peripheres Blut 4 Klassische Befunde Peripheres Blut 5 10

11 Klassische Befunde Peripheres Blut 5 Klassische Befunde Knochenmark 1 11

12 Klassische Befunde Knochenmark 1 Klassische Befunde Knochenmark 1 12

13 Klassische Befunde Knochenmark 2 MDS Variante, med.alt. 67 F>M, rel. gute Prognose, Lenalidomid? Knochenmark aus Patho-Sicht 1 13

14 Knochenmark aus Patho-Sicht 2 Lymphknoten, Milz nur Patho.. Ein Neoplasma bestehend aus B-Zellen (typ. Weise Zentrozyten und Zentroblasten, das meistens zumindest teilweise ein follikuläre Muster aufweist t(14;18), CD10 nicht in Definition 14

15 I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen Leuko: 56000/µl HK: 38% Thrombo: /µl LDH: 311 U/l (-240) γ-glob.: 5.5g/l (6.6-) β2-mikro: 3.0mg/l (-2.7) II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl LDH: 424 U/l (-240) III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen Leuko: 56000/µl HK: 38% Thrombo: /µl LDH: 311 U/l (-240) γ-glob.: 5.5g/l (6.6-) β2-mikro: 3.0mg/l (-2.7) 15

16 I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen Leuko: 56000/µl HK: 38% Thrombo: /µl LDH: 311 U/l (-240) γ-glob.: 5.5g/l (6.6-) β2-mikro: 3.0mg/l (-2.7) II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl LDH: 424 U/l (-240) 16

17 II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl LDH: 424 U/l (-240) III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. 17

18 III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. 18

19 III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. 19

20 Pfeiler der Diagnostik Klinik Laborbefunde Morphologie Zytochemie Pfeiler der Diagnostik Klinik Laborbefunde Morphologie Zytochemie 20

21 Zytochemie POX oder Sudan-Schwarz Färbung Nachweis myeloischer Differenzierung Unspezifische Esterase-Färbung Nachweis monozytärer Differenzierung Myeloperoxidase-Färbung 21

22 Unspezifische Esterase Färbung I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen Leuko: 56000/µl HK: 38% Thrombo: /µl Zellen POX negativ Esterase negativ II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl Blasten POX positiv Esterase negativ III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Zellen POX negativ Esterase negativ 22

23 Durchflusszytometrie von hämatologischen Proben Wie es funktioniert. Der Name Durchflusszytometrie 26

24 Messung des Streulichts der Zellen Unterschiedliche Zelltypen unterschiedliches Streulicht 27

25 Unterschiedliche Zelltypen unterschiedliches Streulicht Darstellung durchflusszytometrischer Ergebnisse 28

26 Exaktere Bestimmung des Zelltyps Färbung von T- und B- Zellen 29

27 Messung der B- und T-Lymphozyten im Durchflusszytometer Filter und Detektoren im Durchflusszytometer Anjani Shah 30

28 Verteilung der T- und B-Zellen Das Gating (Schleusen) 31

29 Was macht man mit der Durchflusszytometrie? Erkennung von lymphatischen Lymphomen/Leukämien Erkennung einer B-Leukämie 32

30 Erkennung maligner B-Zellen durch Nachweis der Monoklonalität Beispiel: Lokales B-Zelllymphom. Knochenmarksbefall? Knochenmarksprobe: Lymphozyten 11% Nur sehr wenige B-Zellen nachweisbar. B- Lymphozyten: 0.4% 33

31 Kappa Lambda Ratio leicht erhöht. KM-Befall?? Kappa: 76% Lambda: 19% K/L-Ratio: 4 CD5-positive B-Zellpopulation auffällig. CD5+ B-Lymphozyten: 0.17% 34

32 Monoklonale Population nachweisbar* Kappa: 96% Lambda: 1.6% K/L-Ratio: 60 *Cave: klonale B-Zellen heißt nicht unbedingt schon Leukämie/Lymphom. Muss im klinischen Zusammenhang beurteilt werden. Erkennung einer Lymphatischen Leukämie / eines Lymphoms durch abnorme Antigenexpression CD5 CD5 CD19 CD19 (CD19=B-Zellmarker, CD5= T-Zellmarker ) 35

33 Erkennung einer Lymphatischen Leukämie / eines Lymphoms durch abnorme Antigen-expression CD8 CD8 CD4 CD4 Was macht man mit der Durchflusszytometrie? Erkennung von lymphatischen Lymphomen/Leukämien Definition der lymphatischen Neoplasie (wenn möglich; sonst Angabe von wahrscheinlichen und unwahrscheinlichen Diagnosen) 36

34 Antigenmuster macht manche lymphatische Neoplasien sehr wahrscheinlich, andere unwahrscheinlich, Beispiel: CD25 - PE CD103 - FITC CD79b - PE CD20 - PERCP CD20 - PERCP CD20 - PERCP Expression von CD103, rel. starke Expression von CD25 ist typisch für... CLL IC PLL MCL HCL FCL SLVL Leichtketten schw CD5 + - bis - bis schw /+ schw + + CD selten +(/-) -/+ + CD11c - bis -/+ -/ /- mittel + (sehr stark) CD (schwächer) + + (schwächer) + CD20 schw CD / /- -/+ CD25 - bis schw + - bis schw /+ CD79b CD /+ 37

35 Was macht man mit der Durchflusszytometrie? Erkennung von Lymphatischen Lymphomen/Leukämien Definition der Lymphatischen Neoplasie Verlaufskontrolle Prognosebeurteilung (CD38, ZAP-70, [CLLU1] bei B-CLL) Prognose des Therapieansprechens (vor geplanter Antikörpertherapie CD20, CD52) Und bei akuten Leukämien? Erkennung (meist gut möglich z.b. mit CD45/SSC oder CD34) Definition der Linie (AML / B-ALL / T-ALL/ biphänotypisch, bilineär) Definition/Ausschluss von Subgruppen (AML: eingeschränkt möglich - M3, M4, M5, M7; B-ALL: etabliert; T-ALL: möglich) Verlaufskontrolle (je nach Immunphänotyp mehr oder weniger sensitive Verlaufskontrolle möglich) 38

36 Die Definition der Linie, der EGIL-Score* Punkte wert B-lymphatisch T-lymphatisch Myeloisch 2 CD79 (zyt./oberfl.) CD22 (zyt./oberfl.) zyt. IgM 1 CD19 CD10 CD TdT CD24 CD3 (zyt./oberfl.) TCR-a/b TCR-g/d CD2 CD5 CD8 CD10 MPO CD13 CD33 CDw65 CD117 CD14 CD15 CD64 * Die WHO 2008 sieht das jetzt etwas anderes, die Tabelle ist aber didaktisch hilfreich Die Einteilung der B-ALL* Antigen Prä-prä B common B prä-b reife B (pro-b) zytigm CD /- +/- sig zytcd22 + CD HLADR CD20 variabel variabel variabel + CD34 +/- +/- -/+ - TdT CytCD79a * Die WHO 2008 stellt diese Einteilung nicht in den Vordergrund, sie hat aber prognostische und damit teilw. therapeutische Bedeutung 39

37 I. Mann 64 Jahre Lymphknotenschwellungen Leuko: 56000/µl HK: 38% Thrombo: /µl LDH: 311 U/l (-240) γ-glob.: 5.5g/l (6.6-) β2-mikro: 3.0mg/l (-2.7) CLL IC PLL MCL HCL FCL SLVL Leichtketten schw CD5 + - bis - bis schw /+ schw + + CD selten +(/-) -/+ + CD11c - bis -/+ -/ /- mittel + (sehr stark) CD (schwächer) + + (schwächer) + CD20 schw CD / /- -/+ CD25 - bis schw + - bis schw /+ CD79b CD /+ 40

38 II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl LDH: 424 U/l (-240) CD CD7 - HLA-DR ++ CD2 - CD33 ++ ntdt - CD13 ++ CD19 - CD ccd3 - cmpo ++ c79a - III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. 41

39 CLL IC PLL MCL HCL FCL SLVL Leichtketten schw CD5 + - bis - bis schw /+ schw + + CD selten +(/-) -/+ + CD11c - bis -/+ -/ /- mittel + (sehr stark) CD (schwächer) + + (schwächer) + CD20 schw CD / /- -/+ CD25 - bis schw + - bis schw /+ CD79b CD /+ 2. PAUSE 42

40 Pfeiler der Diagnostik Klinik Laborbefunde Morphologie Zytochemie Immunphänotypisierung Chromosomenanalyse Karyotypisierung Zellkultur (Inkubation) Zugabe von z.b. Colcemid Spindelfaserinhibitor Auf Objektträger auftropfen Zellen platzen Einfärbung der Bänder (G-Bänder) Befundung im Mikroskop/Computer 45

41 Normales Karyogramm 5q- Syndrom 46

42 t(9;22) Probleme Karyotypisierung I (auch bei optimaler Methodik) Prolifierieren die interessierenden Zellen? In Metaphase sind Blasten von normalen Lymphozyten nicht als solche unterscheidbar 47

43 Beispielbefund Karyotypisierung Patient: 67a, weiblich Zuweisung: ALL Erwünschte Untersuchung: Zytogenetische Karyotypisierung Befund: Die Knochenmarksprobe war hypozellulär. Es gab nur 9 analysierbare Metaphasen. Alle 9 Metaphasen wurden untersucht. 8 Zellen zeigten einen unauffälligen weiblichen Chromosomensatz. Eine Zelle zeigte eine t(9;22). Probleme Karyotypisierung II (auch bei optimaler Methodik) 48

44 Chromosomenspezifische Fluoreszenzmarkierung Multi Color FISH Chromosomenspezifische Fluoreszenzmarkierung Multi Color FISH 49

45 Multicolor FISH Aus Heilmeier et al. DMW, 2009; without permission. Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) z.b. Ausstrich/Zytospin Proteinasebehandlung Dehydratation Ev. nochmalige Proteinasebehandlung Denaturierung (72 C) Dehydratation Hybridisierung Betrachtung im Fluoreszenzmikroskop 50

46 Denaturierung /Hybridisierung z.b. Markierung des Chrom. 12 Interphase-FISH Trisomie 12 51

47 Interphase-FISH Interphase-FISH auf 11,14: (negativ) 52

48 Interphase-FISH Translokation Interphase-FISH 11, 14: t(11;14) 53

49 Wichtige Chromosomenbefunde I MPS, MDS Bitte richtig zuordnen t(9;22) MDS-Untergruppe 5q- JAK2 Mutation PCV 95% (ET 45%, OMS 50%) CML Wichtige Chromosomenbefunde II B-NHL Bitte richtig zuordnen t(11;14) Foll.Lymphom t(14;18) Burkittlymphom t(8;14) t(2;8) od. (8;22) Mantelzelllymphom 54

50 Wichtige Chromosomenbefunde III Akute Leukämien AML mit t(8;21) AML mit inv(16) AML mit t(15;17) B-ALL mit t(9;22) ~ M2 ~ M4Eo ~ M3 schlechte Prognose II. Mädchen 15 Jahre Petechien i.d.oberen Extr. Cervikale Lymphadenopathie, leichte Milzvergrößerung Leuko /µl HK: 32% Thrombo: 22000/µl LDH: 424 U/l (-240) AML t(8;21) 55

51 III. Frau 60 Jahre Autoimmunhämolytische Anämie Leuko 8800/µl Thrombo: /µl Außer Hämolysezeichen keine groben Abweich. t(11;14) Mantelzelllymphom!? 56