Bestimmung von Steroidhormonen in Serum mit LC-MS/MS- von der Methodenentwicklung bis zur Routinetauglichkeit

Transkript

1 Institut für Laboratoriumsmedizin, Klinische Chemie und Molekulare iagnostik Bestimmung von Steroidhormonen in Serum mit LC-MS/MS- von der Methodenentwicklung bis zur Routinetauglichkeit Linda Kortz 6. LC-MS/MS Anwendertreffen Tutzing

2 Einleitung Zielstellung meiner Arbeit - simultane Bestimmung von klinisch relevanten Steroidhormonen aus Serum - schnelle, robuste Methode mit integrierter Probenvorbereitung - LC-MS/MS Setup sollte für andere Anwendungen adaptierbar sein (z.b. Immunsuppressiva)

3 Analytisches Analytisches Target: Target: Steroidhormone Steroidhormone Estriol S 11-eoxycortisol EAS Androstendion EA Cortisol Testosteron Aldosteron ß-Estradiol Androgene Mineralcorticoid Estrogene Glucocorticoid Progesteron 17--Pregnenolon 17--Progesteron Cholesterol Pregnenolon Einleitung

4 Einleitung Immunoassay vs. LC-MS/MS Immunoassay ist die Routinemethode für die klinisch- chem. iagnostik von Steroidhormonen, aber für jeden Analyt ist ein eigener Assay erforderlich.... oft mangelt es an Spezifität.

5 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle

6 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle - Lösungsmittelqualität

7 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle - Lösungsmittelqualität - euterierte Standards

8 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS-Methodenentwicklung Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle - Lösungsmittelqualität - euterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle PLC

9 LC-MS/MS von Steroidhormonen Geräte-Konfiguration Gerätekonfiguration PLC: Shimadzu Prominence MS/MS: 4000 QTrap

10 APCI Ionisierung Steroide bilden M+ + / M Molekülionen Bsp.: 17-P 9.0e [M+] + Intensität, cps 5.0e6 [M+- 2 ] Q1 Spektrum von 17-P 1.0e m/z, amu - Steroidspezifische Bildung von M+ + und M Spezies, zusätzl. M- -

11 APCI Ionisierung Steroide bilden M+ + / M Molekülionen Bsp.: 17-P 9.0e [M+] + 9.0e Intensität, cps 5.0e6 [M+- 2 ] Q1 Spektrum von 17-P Intensität, cps 5.0e5 Produktionenspektrum von m/z e6 1.0e m/z, amu m/z, amu - Steroidspezifische Bildung von M+ + und M Spezies, zusätzl. M- - - charakteristische Fragmente: m/z 97 bzw. 109

12 Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? Ionisierung Spezies Estradiol M EA M EAS M+- 2 S Androstendion M Testosteron M Progesteron M P M ESI APCI APPI S/N S/N eoxycortisol M Aldosteron M Cortisol M Estradiol M Aldosteron M Standard-Mix c= 1 ng/ml (30 µl Injektion auf Trennsäule) S/N

13 Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? Ionisierung Spezies Estradiol M EA M EAS M+- 2 S Androstendion M Testosteron M Progesteron M P M ESI APCI APPI S/N S/N eoxycortisol M Aldosteron M Cortisol M Estradiol M Aldosteron M Standard-Mix c= 1 ng/ml (30 µl Injektion auf Trennsäule) S/N

14 Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? Ionisierung Spezies Estradiol M EA M EAS M+- 2 S Androstendion M Testosteron M Progesteron M P M ESI APCI APPI S/N S/N eoxycortisol M Aldosteron M Cortisol M Estradiol M Aldosteron M Standard-Mix c= 1 ng/ml (30 µl Injektion auf Trennsäule) S/N

15 Ionisierung: ESI, APCI oder APPI? APCI ist guter Kompromiss! Ionisierung ESI APCI APPI Spezies S/N S/N S/N Estradiol M EA M EAS M+- 2 S Androstendion M Testosteron M Progesteron M P M eoxycortisol M Aldosteron M Cortisol M Estradiol M Aldosteron M Standard-Mix c= 1 ng/ml (30 µl Injektion auf Trennsäule)

16 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle - Lösungsmittelqualität - euterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle PLC

17 ie Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Lösungsmittel 1.20E E+05 Signalflächen 8.00E E E+04 Me gradient grade A 2.00E E+00 Estradiol Cortisol Androstendion 11-eoxycortisol Testosteron 17-P EA EAS Aldosteron Progesteron APCI, injiziert wurden 40 µl 10 Mix 1 ng/ml auf die Trennsäule

18 ie Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Lösungsmittel 1.20E E+05 Signalflächen 8.00E E E+04 Me gradient grade A gradient grade B 2.00E E+00 Estradiol Cortisol Androstendion 11-eoxycortisol Testosteron 17-P EA EAS Aldosteron Progesteron APCI, injiziert wurden 40 µl 10 Mix 1 ng/ml auf die Trennsäule

19 ie Wahl des Lösungsmittels beeinflusst die Ionisierung! Lösungsmittel 1.20E E+05 Signalflächen 8.00E E E+04 Me gradient grade A gradient grade B LC-MS A LC-MS B 2.00E E+00 Estradiol Cortisol Androstendion 11-eoxycortisol Testosteron 17-P EA EAS Aldosteron Progesteron APCI, injiziert wurden 40 µl 10 Mix 1 ng/ml auf die Trennsäule

20 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle - Lösungsmittelqualität - euterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle PLC

21 euterierte Standards euterierte Standards zeigen /- Austausch +Q1: 10 MCA scans from Sample 5 (Androstendion-d7_Q1) of LK.wiff (eated Nebulizer) 2.5e6 2.0e Max. 2.6e6 cps [M+] [M+] + + Androstendion-d7 Androstendion e6 1.0e6 5.0e m/z, amu Q1 APCI, 550 C, 1.5 ml/min Me/ 2 50/50 (v/v)

22 euterierte Standards euterierte Standards zeigen /- Austausch +Q1: 10 MCA scans from Sample 5 (Androstendion-d7_Q1) of LK.wiff (eated Nebulizer) 2.5e6 2.0e6 1.5e6 1.0e6 5.0e5 Max. 2.6e6 cps [M+] [M+] + + Androstendion-d7 Androstendion m/z, amu Q1 APCI, 550 C, 1.5 ml/min Me/ 2 50/50 (v/v) +Q1: 10 MCA scans from Sample 9 (Androstendion-d7_Q1_ESI_0C_10uL) of LK.wiff (Turbo Spray) 5.5e7 5.0e7 4.5e7 4.0e7 3.5e7 3.0e7 2.5e7 2.0e7 1.5e7 1.0e7 5.0e m/z, amu Max. 5.6e7 cps Q1 ESI, Raumtemperatur 10 µl/min Me/2 50/50 (v/v)

23 euterierte Standards Stabile deuterierte Standards Cortisol-d4 Androstendion-d7 Testosteron-d3 Estradiol-d3

24 Gliederung Aspekte der LC-MS/MS- Methodenentwicklung - Wahl der Ionenquelle - Lösungsmittelqualität - euterierte Standards - Probenvorbereitung und schnelle PLC

25 Monolithische Trennsäule ermöglicht PLC schnelle PLC bei normalem ruck APCI positiv 4.5e4 Testosteron 4.0e4 Intensität, cps 3.5e4 3.0e4 2.5e4 2.0e4 Estradiol Androstendion 17-P Progesteron 1.5e4 1.0e eoxycortisol EAS Estriol Cortisol Aldosteron EA 17--Pregnenolon Pregnenolon Zeit, min

26 Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von EAS und EA in Realproben PLC Referenzbereiche Serum (ILM) [µg/l] EAS EA ,1-12,5

27 Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von EAS und EA in Realproben PLC Referenzbereiche Serum (ILM) [µg/l] EAS EA 0,1-12,5 S EAS EA M+- 2 S 4 + m/z 271 M m/z 271 Intensivster MRM: 271/213

28 Limitierung: gleichzeitige Quantifizierung von EAS und EA in Realproben PLC Referenzbereiche Serum (ILM) [µg/l] EAS EA 0,1-12,5 S EAS EA M+- 2 S 4 + m/z 271 M m/z 271 Intensivster MRM: 271/213 - Weniger intensiver MRM für EAS nötig, da am Sättigungsbereich des etektors - EA kann in Patientenproben von EAS-Signal überlagert werden Entscheidung für klinisch relevantes EAS

29 Probenvorbereitung Einfache und automatisierte Probenvorbereitung 1. Proteinfällung mit Me/ZnS 4

30 Probenvorbereitung Einfache und automatisierte Probenvorbereitung 1. Proteinfällung mit Me/ZnS 4 2. n-line SPE Isokratische Pumpe Autosampler Abfall SPE-Vorsäule Trennsäule Binäre Pumpe MS/MS Injektion Elution

31 SPE-Säulen Säulen -Vergleich - esorptionsprofile Probenvorbereitung Intensitäti x 10 5, cps Intensität x 10 5, cps Intensität x 10 5, cps Poros Cyclone asis LB Poros R1, mm, 4000 Å, Applied Biosystems Cyclone, mm, 100 Å Cohesive Technologies asis LB, mm, 80 Å, Waters Zeit, min

32 on-line SPE-LC-MS/MS n-line SPE-LC-MS/MS für Steroidhormone Intensität x 10 5, cps APCI positiv Cortisol Aldosteron EAS Estriol Androstendion 11-eoxycortiosol ß-Estradiol Progesteron Testosteron 17--Progesteron 17--Pregnenolon EA Pregnenolon Zeit, min Intensität x 10 5, cps APCI negativ Aldosteron Estriol ß-Estradiol Zeit, min Clin Chem Acta submitted

33 Zusammenfassung - ie APCI ist für die Ionisierung bei der Messung eines Steroidprofils ein geeigneter Kompromiss. - ie Lösungsmittelqualität spielt eine nicht zu unterschätzende Rolle für die Ionisierung. - er Bedarf für unter Quellenbedingungen stabilen deuterierten Standards ist gegeben. - ie Kombination aus on-line SPE und chromatographischer Trennung auf einer monolithischen Säule ermöglicht eine schnelle und effiziente Analytik mit einer Methodenlaufzeit von 4 min ausgehend von 100 µl Serum.

34 Ausblick - Für die Routineanalytik fehlen noch kommerziell erhältliche Kalibratoren und Kontrollen für LC-MS/MS. - ie Methode lief bisher in Batch-Ansätzen. Noch offen ist, wie die Methode über den Zeitraum von einem Jahr läuft, sowie die Adaptierbarkeit anderer Applikationen. - ie on-line SPE-LC-MS/MS für Steroidhormone wird zukünftig in Leipzig für Routinemessungen eingesetzt.

35 anksagung ILM Leipzig r. Uta Ceglarek ipl.-chem. Sven Baumann Babette Niescher r. Martin Fiedler Prof. r. Jürgen Kratzsch Prof. r. Joachim Thiery Institut für Analytische Chemie, Uni Leipzig Prof. r. Stefan Berger Applied Biosystems r. Jan Lembcke, r. Roland Geyer