Biosensoren und ihre Potentiale für die Lebensmittelindustrie

Transkript

1 Biosensoren und ihre Potentiale für die Lebensmittelindustrie Reinhard Nießner TU München Institut für Wasserchemie & Chemische Balneologie Lehrstuhl für Analytische Chemie

2 Motivation Entwicklung von Biosensor-Plattformen, welche komplette meßtechnische Fragestellungen beantworten können : - Welche Plattformen gibt es prinzipiell? - Welche Biorezeptoren stehen zur Verfügung? - Gibt es geeignete Fragestellungen? - Können diese bestehende Verfahren ersetzen? - Wo liegt der Forschungsbedarf?

3 Platte Formen Bio Compact Disc M. Madou (2001)

4 Mikroarrays? Analogon zu existierenden DNA - Chips - Unterschiedlich affine Bindepartner (Rezeptoren) in geringsten, aber räumlich diskreten Mengen - Flächige Architektur - Einbindung in Mikrofluidik (Probenahme, Anreicherung, Regeneration) - Nutzung einer seriell oder hochparallelen Auslesung

5 ISI Web of Knowledge Stichwort Protein Microarray Stand :

6 Vorteile von Mikroarrays Große Chipfläche mit hoher Redundanz der Bindestellen steigert Reproduzierbarkeit Chipherstellung in großer Stückzahl mit hoher Reproduzierbarkeit : Zertifizierbarkeit Reagenzverbrauch äußerst gering Bindeprozesse sind schnell und kinetisch in Echtzeit verfolgbar Quantifizierung der Bindung zwischen Rezeptor (z.b. Antikörper) und Analyt ermöglicht Beurteilung einer funktionellen Affinität : Screening von Bindepartnern Affinitätskonstanten von Mol -1 ergeben femtomolare Nachweisgrenzen Bindepartner mit unterschiedlicher, aber definierter Querempfindlichkeit und Pattern recognition machen Varianten/Metaboliten eines Analyten meßbar Trägerstruktur vielfach variierbar : Lichtleitfaserbündel bis Compact Disc

7 Der Chip an sich

8 Mikroarray - Herstellung Kontakt spotting Bindepartner und Referenz werden als Mikrospot (Ø = 500 µm) auf den Chip gebracht

9 NHS-aktivierte Glas Chips A. Wolter, R. Niessner & M. Seidel (2007) Anal. Chem. 79, 4529 spotting O N O O HN directly coupling spotting O H 2 N O S O H N N N R R R= H SDA R=CH 3 SMA Protein - Mikroarrays PEG- NHS OMe OMe OMe Hapten - Mikroarrays NH 2 NH 2 NH 2 NH 2 O O O O GOPS glass substrate

10 Kontrolle einer DAPEGfunktionalisierten Oberfläche Δ CL Signal : < 4 % S/N = 600 : 1 Δ CL Signal : < 8 %

11 Hapten- und Protein - Mikroarrays Arbeitsprinzip

12 Hapten - Mikroarray Testformat Kompetitiver ELISA Kleine Analytmoleküle (Antibiotika, PAHs, Pestizide, Toxine, Pharmazeutika...) Chemisch stabile Oberfläche Kalibrierung notwendig Regenerierbare multi-use Chips relative intensity [%] TMP: 34,4 µg/l LOD: 2,9 µg/l , SDA [µg/l]

13 Protein - Mikroarray Testformat Sandwich-ELISA Analyten : Cytokine, Mikroorganismen, Viren, hochmolekulare Toxine... Chemisch stabile Oberfläche Kalibrierung nicht möglich auf demselben Chip single-use Chip SCL signal [a.u.] c(hrp) [ng/ml]

14 Die Mikroarray - Plattform Aufbau Auslesung Mikrofluidik

15 Das komplette Meßsystem Reservoir Pumpen Mikroarray Antikörper Flüssigprobe Laptop

16 Das Ausleseprinzip M. Weller, A. Schütz, M. Winklmair & R. Niessner (1999) Anal. Chim. Acta 393, 29 Chip with hapten microarray Lens Out In CCD camera Sample loop Flow cell Syringe pumps with sample, antibody solutions, substrate and washing buffer Computer

17 Das Fluidiksystem

18 Die Hardware

19 Protein - Mikroarrays zur schnellen Detektion von Bakterien

20 Antikörper - Mikroarray A. Wolter, R. Niessner & M. Seidel (2007) unveröffentlicht Assay - Prinzip : Sandwich - ELISA Plattform : Antikörper - Mikroarray Auslesung : Chemilumineszenz

21 Zelldichte am Rezeptor - Spot S. typhimurium A B C D CL - Signale A 4,5 x 10 5 ± 1,7 x 10 4 Zellen/ml Spot Ø : 450 µm (mikroskopisch) 457 µm (CCD - Bild) Zellen/Spot (1A - 6A) : ~ 120

22 Kalibrierung für E. coli O157:H7 A. Wolter, R. Niessner & M. Seidel (2007) unveröffentlicht 0 0-Ref 1x10 5 4x10 5 2x10 6 1x10 7 5x10 7 Zellen/mL Arbeitsbereich : 1 x x 10 5 Zellen/mL; LOD: 6,6 x 10 3 Zellen/mL

23 Kreuzreaktivität A. Wolter, R. Niessner & M. Seidel (2007) unveröffentlicht E. coli O157:H7 S. typhimurium C. bjejuni Positivkontrolle pab E. coli O157:H7 pab Salmonella pab Campylobacter 3,6x10 7 E.coli O157:H7 cells 6x10 7 S. typhimurium cells 5,8x10 7 C. jejuni cells pab E.coli ± ± ± pab Salmonella ± ± ± pab Campylobacter ± ± ± 5.845

24 Simultane Detektion von Rückständen in Milch

25 Antibiotika in Milch - Antibiotika sind vielfältig im Kuhstall zu finden (Wachstumspromotor, Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten) - In Milch unerwünscht (Resistenz, Inhibition von Starterkulturen bei Joghurt und Käseproduktion) - Schnelle Vor - Ort - Detektion sichert Einhaltung von Vorsorgegrenzwerten und schützt vor finanziellen Einbussen

26 Potenzielle Antibiotika in Milch

27 Nachweisverfahren : Indirekter kompetitiver ELISA

28 Parallele Analyse of 10 verschiedenen Antibiotika in Milch B. Knecht, M. Weller & R. Niessner (2004) Anal. Chem. 76, 646

29 Kalibrierfunktionen für Sulfonamide K. Kloth, R. Niessner & M. Seidel (2007) relative intensity [%] H 2 N O S O H N N N TMP: 34,4 µg/l LOD: 2,9 µg/l , SDA [µg/l] relative intensity [%] H 2 N O S O H N N N TMP: 20,4 µg/l LOD: 3,3 µg/l Arbeitsbereich : µg/l Arbeitsbereich : µg/l , SMA [µg/l]

30 Chip Regenerierbarkeit K. Kloth, R. Niessner & M. Seidel (2007) SCL [au] SMA SDA Biotin Regenerationsmedium : HCl/Glycin - Puffer ph 3, mit 0,1% Na - Dodecylsulfat regeneration cycles

31 Perspektiven Gelingt die Ablegung vollständiger Aufgaben als Mikroarray, - werden weitreichende Anwendungsfelder in unmittelbarer Nutzernähe zugänglich - werden orthogonale Erkennungsstrategien die Sicherheit einer Identifizierung erhöhen - instrumentell und zeitlich aufwendige Analysenverfahren ersetzt bzw. entlastet.

32 Forschungsbedarf Existieren geeignete Fragestellungen für Mikroarrays? Gibt es genügend geeignete Bindepartner, die die Etablierung einer Plattform über Jahre hinweg sichert? Auslesesystem im analytischen Sinn robust? Miniaturisierbarkeit? Wie muß die Probe konditioniert sein, um Chip-kompatibel zu sein? Konsekutive Kalibrierung, z.b. nach Regeneration, durchführbar?

33 Danksagung AK Märtlbauer, LMU München AG Dr. M. Seidel FEI : AIF ZUTECH Programm Deutsche Forschungsgemeinschaft BMBF (Deutsch- Japanische Kooperation)