Comprehensive LC. Dr. Björn-Thoralf Erxleben Manager HPLC / Dataprocessing Shimadzu Europa GmbH
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- Bernd Seidel
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1 Comprehensive LC Dr. Björn-Thoralf Erxleben Manager HPLC / Dataprocessing Shimadzu Europa GmbH
2 Überblick Was ist Warum Wie realisiert Welche Herausforderungen Was ist notwendig Was ist möglich Wohin geht s
3 Fragen Sind Sie zufrieden mit Ihren Ergebnissen? Hinterfragen Sie die Resultate? Stellen Sie sich die Frage, was sehe ich vielleicht nicht?
4 Mögliche Lösungsansätze Neue Detektoren / Methoden 3D Verfahren MS (MS/MS) Detektion Zusätzliche Analysen / Probenvorbereitung Mehrdimensionale Chromatographie
5 Mehrdimensionale LC Lösungsansätze Trapping / Aufkonzentrieren Peak ausschneiden Fraktionierung / Re-injektion Comprehensive
6 LCXLC: Comprehensive LC Zweidimensionale HPLC Eluat der ersten Dimension wird in einer zweiten Dimension erneut chromatographiert Kein Parken von Peaks oder Schneiden von Peaks aus dem Chromatogramm der ersten Dimension kontinuierliche Chromatographie
7 LCXLC Höhere Auflösung Höheres Identifizierungsvermögen durch Gruppierung chemisch verwandter Strukturen (Fingerprint)
8 System Konfiguration 0.1 mm id In/out Cappillaries (L= approx. 300mm>> Approx. 5 ul Smaller Sample Loop: 0.17 mm i.d. L= 710mm (approx. 16 ul, can be used up to 10 ul) LC 1: 2 x LC-20AD with 100 ul Semi Micro Mixer in CTO-20AC Detector: SPD-M20A with standard and semi micro cell LC 2: LC-20AB with 500 ul Mixer in CTO- 20AC Detector: SPD-20A with standard cell Build In 2-pos/10- port valve controlled by CBM-OUT 4 (Event)
9 Ventil Schaltung 20 ul Loops
10 Methodenentwicklung Säulenselektivität Orthogonalität der Trennmechanismen Peakkapazität
11 Peakkapazität Die Peakkapazität N 2D des Systems gleich dem Produkt der Peakkapazitäten N 1, N 2 der einzelnen Dimensionen. (orthogonale Methoden mit nicht korrelierenden Retentionszeiten) N 2D =N 1 X N 2 Dixon, Perret Biomed, Chromatography 20 (2006), 508
12 LCXLC Methoden Unterschiedliche Selektivität beider Trennsysteme Einfluß auf die Systemorthogonalität und die Peakkapazität Beste Resultate mit orthogonalen Systemen mit nicht korrelierenden Retentionszeiten in beiden Dimensionen Echte 2D Systeme mit nicht korrelierenden Retentionszeiten nur selten anzutreffen
13 Methoden Optimierung Parameter Stationäre Phase, Mobile Phase, Temperatur Zusammensetzung der Laufmittel oder Temperaturgradienten in beiden Dimensionen um maximale Peakkapazität sicherzustellen Kompatibilität der mobilen Phase und ggf. Effekte beim Peak Transfer Abgleich der Säulenabmessungen und Flußraten in beiden Dimensionen Transfer Volumen und Frequenz, Anzahl der Zyklen für die 2. Dimension Modulationsfrequenz-Anpassung um mögliche Bandenverbreiterung zu unterdrücken und Peaks zu fokussieren
14 Methodenentwicklung Anzahl der theoretisch möglichen Kombinationen zum Erreichen von Orthogonalität ist relative groß Schwierige Kombination / Ausschlüsse Mischbarkeit der mobilen Phasen Ausfallen der Puffersalze Inkompatibilität zwischen Mobiler Phase der ersten Dimension und der stationären Phase der zweiten Dimension Kompatibilität möglich oder herstellbar RP X RP RP X IEC SEC x RP SEC X NP Generell Kombination zwischen NP und RP schwierig auf Grund der Mischbarkeit der mobilen Phasen
15 Probentransfer Grundsatz: Beibehaltung der Auflösung der ersten Dimension Injektion jedes Peaks der ersten Dimension für die 2 Dimension 3-4 mal (Murphy (Anal. Chem 70(1998) 1585)
16 Probentransfer Methodenentwicklung / -anpassung Optimierung der Analysenzeit für die zweite Dimension Danach Anpassung der Flußrate um 3-4 Schnitte pro Peak zu erreichen Möglichst Gradientenprogramm für die zweite Dimension um Peakbreiten über die gesamte Analysenzeit konstant zu halten
17 Methoden (1) Kontinuirliche LCXLC Laufzeit für die 2te Dimension = Transferzeit der Probe der ersten Dimension Gesamtlaufzeit = Laufzeit der Analyse in der zweiten Dimension * Anzahl der Injektionen (des Eluates) in die zweite Dimension
18 Methoden (2) Stop-Flow LCXLC Nach dem Transfer der Probe in die mobile Phase der zweite Dimension Fluß der ersten Dimension angehalten Vorteil: Längere Laufzeit für die 2. Dimension, längere Säulen größere Anzahl theoretischer Böden Nachteil: Sehr lange Gesamtlaufzeit; u.u. Bandenverbreiterung
19 Funktionsweise LCXLC Eluate der ersten Dimension wird direkt auf eine weitere Trennsäule injiziert Kombination verschiedener Trennprinzipien (z. Bsp. GPC und RP Chromatographie) Unterschiedliche Trennsysteme (Säulen + Mobile Phasen)
20 Herausforderungen Mischbarkeit der mobilen Phasen Säulenauswahl Unabhängige Gradienten / Optimierung Geschwindigkeit der Detektoren Probendurchsatz Auswertung / Interpretation
21 Optimierungen der NPLC x RPLC Überlegungen: Echte Trennung in beiden Dimensionen Zusammensetzung der mobilen Phase der zweiten Dimension Lösungsmittelstärke, Elutionsvermögen Flurate und Laufzeit der zweiten Dimension Flußrate der ersten Dimension Breite der Peaks der ersten Dimension
22 Kopplung zwischen NP und RPLC Beim Transfer von vergleichsweise großen Volumina eines inkompatiblen Eluenten von der ersten zur zweiten Dimension kann es zu Bandenverbreiterung oder zu Peakverzerrungen kommen Einsatz einer Micro-Bore LC Säule gestattet es kleine Volumina zu übertragen und so auch inkompatible Lösungsmittel ohne die Peakschärfe oder Auflösung zu verschlechtern
23 Peak Fokussierung Mobile Phase einer Normalphasen LC ist stärker als die Mobile Phase auf der zweiten Säule Für effektive Fokussierung: Starkes Elutionsmittel der ersten Dimension trifft auf schwaches Elutionsmittel am Anfang der zweiten Dimension Um alle Komponenten vor der folgenden Injektion zu eluieren ist ein reproduzierbares Gradientenprogramm notwendig
24 2 Dimension - Fast LC Höchste Gradientenreproduzierbarkeit ist notwendig, gerade wenn die Unterschiede in Polarität und Hydrophobizität groß sind und isokratische Bedingungen nicht ausreichen oder schwer zu realisieren sind um kurze Laufzeiten zu garantieren Möglichkeit einer Gradientenelution für die zweite Dimension erweitert das Potential der LCXLC erheblich
25 Monolithische Säulen für die zweite Dimension? Positiv Schrittweises Arbeiten mit nur kurzem Einlaufen der Methode vor dem Neustart Vergleichsweise große Flußraten ohne Einbußen an Auflösung damit kurze Analysenzeiten
26 NPLC X RPLC vs. AgLC X RPLC Unkompatible Lösungsmittel werden verwendet Microbore HPLC Säulen in der ersten Dimension gestattet kleine Flußraten mit Transfervolumen, dass einer normalen Probenmenge für eine konventionelle Säule und Flußrate entspricht Elutionskraft der mobile Phase der ersten Dimension ist signifikant stärker als in der 2. Kleine Volumen auf die 2. Dimension übertragen um die Elutionskraft für den Start der 2. Trennung weitestgehend zu reduzieren
27 Datenerfassung Detektor üblicherweise nach der 2. Dimension 3D Detektor um ein Maximum an Information zu erhalten: PDA, MS, MS/MS Mehrere Detektoren hintereinander Optionaler Detektor nach der ersten Dimension Methodenentwicklung (einfachere Visualisierung)
28 Erste Dimension Zweite Dimension Darstellung
29 Comprehensive Manager Direktes Verarbeiten von Daten der LabSolution Software (LC, LCMS, GC, GCMS) 3D Darstellung der Ergebnisse Quantitative Berechnung
30
31 Beispiel Analyse Kombinationspräparats (Analgetica, Antipyretica) Tablette 4 Wirkstoffe angegeben Standard LC Bedingungen 1 mm 150 mm Säule in der ersten Dimension 2* 50 mm Säule in der zweiten Dimension
32 Comprehensive LC - erste Dimension Erste Dimension
33 Zweite Dimension
34 Zweite Dimension (Zoom)
35 Software - Standardansicht
36 Erster Peak in der LCXLC
37 Contour Ansicht (Zoom)
38 Peak Berechnung
39 Beispiele
40 Beispiele
41 Fettsäureester
42 Leinöl
43 Eselsmilch
44 Carotenoide in Orangenöl NP
45 Beispiele
46 Beispiele
47 Phenolische Antioxidantien
48 Fettsäuren in Sojabohnen
49 AFC 37 C:\LCMSsolution\User\Data\trigliceridi\Plasma\MD\run002.qld X10 sec CS CP CHOLESTERYL ESTERS DB (FA) CO Human blood serum lipids TRIACYLGLYCEROLS DB CM CPo CEt PPS POS SPO+PSO SOO POO OOO CL M C14:0 P C16:0 Po C16:1ω7 S C18:0 O C18:1ω9 L C18:2ω6 Ln C18:3ω3 Et C20:3ω6 Ar C20:4ω6 Dh C22:6ω3 C Cholesteryl CLn CAr CDh PPP POP PPO PPoO MOP MPoO POL PoOO OOL POAr PLO PPoL PLL OPoL OLL ArOO X10 min
50 C² für wen? Pharmazeutische Industrie Wirkstoffforschung / Identifizierung zusätzlicher Syntheseprodukte bzw. Metaboliten QA/QC Chemische Industrie Identifizierung von Kunststoffen und Zusatzstoffen Naturstoffchemie Lebensmittelanalytik Spurenanalytik Klinische Chemie / Biochemie Proteomics / Metabolomics Online Probenvorbereitung
51 Einflussfaktoren Auflagen und Bestimmungen zur Charakterisierung von Nebenprodukten und Verunreinigungen in pharmazeutischen Wirkstoffen Detaillierte Ergebnisse für zielgerichtete Therapie
52 Kopplung LC / GC LC als Probenvorbereitung für die GC Analyse Kopplung SEC mit GC(MS) Arbeitsweise Relative langsame LC Methode (niedrige Flußrate) Überführung des Eluates für die GC Injektion in die Spritze Anhalten der LC / Injektion GC GC Trennung / LC Eluate für erneute Injektion in die Spritze
53 Zusammenfassung Comprehensive LC Möglichkeiten / Methoden Auflösung /Identifizierung Interpretation / Spezialisten
54 was sehen wir?
55 Danksagung Universität Messina Prof.L. Mondello, Prof. P.Dugo, T. Kumm Shimadzu Corp. Y. Kono, T. Yanagisawa Shimadzu Europa GmbH R. Ludwig
56 ProminenceC² setup
57
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