GC-MS/MS-Multimethode zur Bestimmung von Daidzein, Genistein, Bisphenol A und Naphtholen in Urin für Bevölkerungsstudien

Größe: px

Ab Seite anzeigen:

Download "GC-MS/MS-Multimethode zur Bestimmung von Daidzein, Genistein, Bisphenol A und Naphtholen in Urin für Bevölkerungsstudien"

Karoline Beutel
vor 6 Jahren
Abrufe

Lukas Schmidt, Johannes Müller, Thomas Göen Institut und Poliklinik für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen 51.

1 Lukas Schmidt, Johannes Müller, Thomas Göen Institut und Poliklinik für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin der Universität Erlangen-Nürnberg, Erlangen 51. Wissenschaftliche Jahrestagung Heidelberg, März 2011 Einleitung Die Allgemeinbevölkerung ist mit zahlreichen Stoffen exponiert, für die eine endokrine Wirksamkeit bekannt ist. Zu diesen Stoffen zählen sowohl Verbindungen, die durch industriell-chemische Prozesse gebildet werden (Xenoöstrogene), als auch Naturstoffe (Phytoöstrogene). Die wichtigsten Phytoöstrogene sind das Daidzein (DAI) und das Genistein (GEN), die insbesondere in Sojaprodukten enthalten sind. Dagegen stellt Bisphenol A (BPA) eines der prominentesten Xenoöstrogene dar. 1- und 2-Naphthol (1-Np, 2-Np) können als humane Metabolite des Naphthalins ebenfalls den Xenoöstrogenen zugeordnet werden (Abb. 1). 1-Naphthol 2-Naphthol Bisphenol A Ziel Ziel war die Etablierung einer Biomonitoringmethode, die die simultane Bestimmung von Daidzein, Genistein und Bisphenol A sowie 1- und 2- Naphthol im Urin der Allgemeinbevölkerung ermöglicht. Genistein Daidzein Biomarker: R = H Derivate: R = tert-butyl-dimethylsilyl Abb. 1: Strukturformeln der Biomarker und der Analyten

Signal Analytisches Verfahren Für die Probenaufarbeitung werden die im Urin vorliegenden Konjugate der Analyten mittels ß-Glucuronidase/Arylsulfatase enzymatisch hydrolysiert.

2 Signal Analytisches Verfahren Für die Probenaufarbeitung werden die im Urin vorliegenden Konjugate der Analyten mittels ß-Glucuronidase/Arylsulfatase enzymatisch hydrolysiert. Nach anschließender Festphasenextraktion (SPE) erfolgt eine Silylierung der freien Hydroxy-Gruppen durch MtBSFTA. Nach gaschromatographischer Trennung an einer ZB-5ms Säule (Abb. 2) werden die Analyten im Tandem-Massenspektrometer (GC-MS/MS) strukturspezifisch detektiert (Tab. 1) und quantifiziert. Um die bei der Probenaufarbeitung und Messung auftretenden Variationen sowie die Unterschiede in der Extraktionsausbeute auszugleichen, wurden deuterierte interne Standards (IS) für alle Analyten eingesetzt (D7-1-Np, D7-2-Np, D4-BPA, D3-DAI, D4-GEN). Für die Analyse ist eine Urinmenge von 1mL ausreichend. 2,5x10 3 2,0x10 3 1,5x10 3 1,0x10 3 5,0x10 2 D7-1-Np 1-Np 2-Np D7-2-Np D4-BPA BPA D3-DAI DAI D4-GEN Tab. 1: GC-MS/MS Daten und MRM Parameter der Analyten. GEN 1-Np 2-Np BPA DAI GEN Retentionszeit [min] 7,53 7,63 10,55 14,19 15,81 Precursor-Ion [m/z] Produkt-Ion [m/z] ,0 7,5 10,5 12,0 13,5 15,0 16,5 Zeit [min] Abb. 2: GC-MS/MS Chromatogramm einer mit 1µg/L (1-Np, 2-Np, BPA) und 5µg/L (DAI, GEN) dotierten Urinprobe

3 Fläche Methodenoptimierung Für die Optimierung der Derivatisierungsreaktion mit MtBSTFA wurden identische Analysenproben (ohne Matrix und IS) bei unterschiedlichen Temperaturen (25 C, 45 C und 60 C) und mit verschiedener Dauer (10-120min) derivatisiert. Die bei der Analyse erhaltenen absoluten Flächenwerte wurden als Maß des Derivatisierungsgrades ausgewertet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Derivatisierung mit MtBSTFA unabhängig von Derivatisierungsdauer und temperatur abläuft (Abb. 3). Um den Einfluss der Menge an MtBSTFA auf die Derivatisierungsausbeute zu ermitteln wurden identische Analysenproben (ohne Matrix und IS) mit verschiedenen Mengen MtBSTFA umgesetzt. Die Auswertung zeigte, dass bei einem Anteil von 30% Vol. MtBSTFA (i.e. 50µL) in der Analysenlösung für alle Analyten annähernd maximale Signalstärken erreicht werden (Abb. 3). Für das Standardverfahren wurde deshalb die Zugabe von 50µL MtBSTFA auf 100µL Analysenlösung, Raumtemperatur (25 C) und eine Dauer von 10min als Derivatisierungsbedingungen gewählt. Fläche Np 2-Np BPA DAI GEN Derivatisierungszeit [min] Abb. 3: Abhängigkeit der Derivatisierung bei 25 C bzw. 60 C von der Zeit sowie von der eingesetzten Menge an MtBSTFA (Derivatisierung bei 25 C) bei 25 C bei 60 C 6x10 4 5x10 4 4x10 4 3x10 4 2x10 4 1x Np 2-Np BPA DAI GEN MTBSTFA [% Vol. in Messlösung] Derivatisierungszeit [min]

4 Methodenvaldierung Für die Validierung des Verfahrens wurde ein Probenvolumen von 1mL Urin verwendet. Zur Bestimmung der Nachweis- (NG) und Bestimmungsgrenzen (BG) wurden mittlere äquidistante Kalibrierproben in Urin (in Dreifachbestimmung) im Konzentrationsbereich von 0-26µg/L (1-Np, 2-Np, DAI, GEN) bzw. 0-2,4µg/L (BPA) vermessen und nach DIN ausgewertet (Abb. 4). Mit der entwickelten Methode wurden dabei für alle Parameter sehr geringe BG zwischen 0,3 und 2µg/L erreicht (Tab. 2). Die Kalibrierungen waren im gesamten untersuchten Bereich (1-, 2-Np: BG-75µg/L; BPA: BG-20µg/L; DAI, GEN: BG-180µg/L) linear und varianzhomogen. Für die Bestimmung von Richtigkeit und Präzision wurden dotierte Urinproben aus dem G-EQUAS-Ringversuchsprogramm herangezogen und die Ergebnisse aus mindestens sechs unabhängigen Bestimmungen ausgewertet (Tab. 3). Tab. 2: NG und BG nach DIN für 1-Np, 2-Np, BPA, DAI und GEN. 1-Np 2-Np BPA DAI GEN NG [µg/l] 0,2 0,1 0,1 0,3 0,6 BG [µg/l] 0,9 0,4 0,3 1,1 2 Tab. 3: Richtigkeit und Präzision der Methode für 1-Np (c=7-43µg/l), 2-Np (8-53µg/L), BPA (3-7µg/L), DAI und GEN (20-50µg/L). (n=6) 1-Np 2-Np BPA DAI GEN Präzision (Serie) [%] Präzision (Tag zu Tag) [%] Richtigkeit [%]

5 Fläche / Fläche IS GC-MS/MS-Multimethode zur Bestimmung von Daidzein, Genistein, Fläche BPA/Fläche IS Fläche / Fläche IS Np BPA GEN y=0,82138x+0,2509 R²=0, Np y=0,89317x+0,3910 R²=0,9999 0,35 0,30 0,25 0,20 y=0,10766x+0,0673 R²=0,9943 2,5 2,0 1,5 y=0,07226x+0,54547 R²=0,9995 DAI y=0,03828x+0,15899 R²=0, ,15 1, ,10 0, Konzentration [µg/l] 0,05 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 Bisphenol A [µg/l] 0, Konzentration [µg/l] Abb. 3: Kalibriergeraden in Urin zur Bestimmung von NG und BG von 1-Np, 2-Np, BPA, DAI und GEN nach DIN 32645; Mittelwert ± Standardabweichung (n=3)

6 Diskussion der Methode Aufgrund ihrer strukturellen Ähnlichkeit und des daraus resultierenden ähnlichen Verhaltens bei der Probenvorbereitung, wurde für die Parameter 1-Np, 2-Np, BPA, DAI und GEN eine schnelle, selektive und sensitive GC-MS/MS-Multimethode entwickelt und optimiert. Gegenüber anderen publizierten Biomonitoringmethoden (Grace et al. 2003; Moors et al. 2007) konnten die Bestimmungsgrenzen für die Biomarker BPA, DAI und GEN deutlich verringert und das Analytenspektrum um die simultane Bestimmung von 1-Np und 2-Np erweitert werden. In allen bisher untersuchten Leerurinen sowie in den nicht mit GEN und DAI dotierten Ringversuchsproben wurden GEN- und DAI- Konzentrationen zwischen 20 und 200µg/L nachgewiesen. Die Belastungen für BPA, 1-Np und 2-Np in den Leerurinen waren deutlich geringer, jedoch mit dem neuen Verfahren in jeder Probe oberhalb der Nachweisgrenze. Aufgrund des ubiquitaren Vorkommens von BPA ist die Kontamination aller an der Analyse beteiligen Geräte und Lösungen durch geeignete Maßnahmen zu minimieren und durch Verfahrensleerwerte zu kontrollieren. Schlussfolgerungen Die von uns entwickelte Multimethode ermöglicht mit hoher Sensitivität und Selektivität in kürzester Zeit die simultane Bestimmung der humanen Biomarker für fünf endokrin wirksame Stoffe. Durch die schnelle Probenaufarbeitung, das geringe geforderte Probenvolumen und die niedrigen Bestimmungsgrenzen, eignet sich die entwickelte Analysenmethode besonders gut für das Biomonitoring dieser prominenten endokrin wirksamen Stoffe in Bevölkerungsstudien. Literatur Grace, P. B., J. I. Taylor, et al. (2003). "Quantification of isoflavones and lignans in urine using gas chromatography/mass spectrometry." Analytical Biochemistry 315(1): Moors, S., M. Blaszkewicz, et al. (2007). "Simultaneous determination of daidzein, equol, genistein and bisphenol A in human urine by a fast and simple method using SPE and GC-MS." Mol. Nutr. Food Res. 51(7):

Ähnliche Dokumente

2,3-Dihydroxypropionamid (OH-PA) ein weiterer oxidativer Metabolit von Acrylamid (AA) in Urinen der Allgemeinbevölkerung

2,3-Dihydroxypropionamid (OH-PA) ein weiterer oxidativer Metabolit von Acrylamid (AA) in Urinen der Allgemeinbevölkerung 2,3-Dihydroxypropionamid (H-PA) ein weiterer oxidativer Metabolit von Acrylamid (AA) in Urinen der Allgemeinbevölkerung J. M. Latzin, H. M. Koch, T. Weiß,. Koslitz, B. K. chindler, J. Angerer, T. Brüning