Quantifizierung von Glutathion und Cystein in

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1 TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Lebensmittelchemie Quantifizierung von Glutathion und Cystein in Getreideprodukten und Erythrozyten Julia Theresia Reinbold Vollständiger Abdruck der von der Fakultät für Chemie der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation. Vorsitzender: Univ.Prof. Dr. P. Schieberle Prüfer der Dissertation: 1. apl. Prof. Dr. P. Köhler 2. Univ.Prof. Dr. M. Schuster Diese Dissertation wurde am bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät für Chemie am angenommen.

2 I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Glutathion und Cystein Geschichte und Struktur Physikalische und chemische Eigenschaften Vorkommen und Biosynthese Funktionen von Glutathion Glutathion und die Gesundheit des Menschen Getreide Überblick über Herkunft und Verwendung Inhaltsstoffe von Weizenmehl und deren Bedeutung für die Backeigenschaften Niedermolekulare Thiole in Weizenmehl Analytik von Glutathion und Cystein Verschiedene Methoden zur Analytik von Glutathion und Cystein Analytik von Glutathion und Cystein in Weizenmehlen und Weizenprodukten Analytik von Glutathion in Erythrozyten Stabilisotopenverdünnungsanalyse mittels HPLCMS/MS Fazit 34 2 Problemstellung 35 3 Ergebnisse und Diskussion Synthese der isotopologen Standardsubstanzen Versuche zur Methodenentwicklung ohne Derivatisierung Chromatographische Trennung der Analyten Optimierung der Parameter für die HPLCMS/MS Messungen und GSSG 44 von GSH Response, Linearität und Empfindlichkeit Diskussion zur Methodenentwicklung ohne Derivatisierung Allgemeine Methodenentwicklung mit Derivatisierung der Analyten Untersuchung verschiedener Reagenzien zum Schutz freier Thiolgruppen Derivatisierung von Glutathion und Cystein mit lodessigsäure und Dansylchlorid Gewinnung der Derivate von GSH, GSSG, CSH und CSSC Optimierung der Parameter für die HPLCMS/MS Messungen 55

3 Erythrozyten Weizenmehl Glutathion ein II 3.4 Methodenentwicklung Response und Linearität Thiol/DisulfidAustausch, Oxidation und Reduktion während der Probenaufarbeitung Optimierung und Modifizierung der Probenaufarbeitung Methodenvalidierung Quantifizierung von GSH, GSSG, CSH und CSSC in Getreideprodukten Quantifizierung von GSH, GSSG, CSH und CSSC in verschiedenen Getreidemehlen Veränderung von GSH, GSSG, CSH und CSSC während der Teigbereitung, der Gare und des Backvorgangs Veränderung von GSH, GSSG, CSH und CSSC während der Keimung Gesamtglutathion und cystein in Mehlen mit unterschiedlicher Schwefeldüngung und deren Korrelation mit Teig und Backeigenschaften Gesamtglutathion und cystein in Dinkel und Einkornmehlen Methodenentwicklung in Erythrozyten Vorüberlegungen Optimierung der Parameter für die LCMS/MS Messungen Response und Linearität Ausschluss von Isotopeneffekten Natürliche Isotopenverteilung Probenvorbereitung Versuche zur Quantifizierung von Glutathion und Glutathionsulfonsäure in Erythrozyten Anwendung der entwickelten Methode Glutathiondisulfid in Erythrozyten Glutathionsulfonsäure in Erythrozyten Artefakt Diskussion zur Quantifizierung von Glutathion in Erythrozyten Zusammenfassung Experimenteller Teil Chemikalien und Material Untersuchungsmaterial Isotopenmarkierte Verbindungen Lösungsmittel für NMRMessungen Sonstige Chemikalien Charakterisierung der Mehle Bestimmung des Stickstoff/Proteingehaltes nach DUMAS Bestimmung des Wassergehaltes von Mehl Bestimmung des Aschegehaltes von Mehl 149

4 III Isolierung der Proteinfraktionen zur Bestimmung des Gehaltes mittels modifizierter verschiedener Proteinfraktionen und typen OsborneFraktionierung Synthesen Darstellung von reduziertem yglutamyl[13c3, 15N]cysteinylglycin Darstellung von oxidiertem yglutamylcysteinyl[13c2, 15N]glycin Darstellung von NDansylCarboxymethylcystein und NDansyl Carboxymethylglutathion Darstellung von N.N'Didansyl GSSG Darstellung von NDansylGlutathionsulfonsäure Darstellung von [13C3, 15N]Glutathionsulfonsäure Rheologische Methoden und Backversuche Mikrobackversuch / Teigherstellung für rheologische Untersuchungen Volumenmessung Zugversuche KriechErholungsVersuche Oszillationsmessung (Stressrampe) Backversuch zur Bestimmung von GSH, GSSG, CSH und CSSC während der Teigbereitung, der Gare und des Backvorgangs Bestimmung der Wasseraufnahme im Farinographen Teigbereitung und Backvorgang Keimung Gewinnung von Erythrozyten Derivatisierungen Derivatisierung von Thiolen mit 4Vinylpyridin Derivatisierung von Thiolen mit 2,2'Dinitro5,5'dithiodibenzoesäure Derivatisierung von Thiolen mit lodessigsäure Derivatisierung von Thiolen mit NEthylmaleinimid Analytische Methoden Kernresonanzspektroskopie (NMR) HPLCUV HPLCMS/MS (TSQ) HPLCMS/MS (HCT Ultra) MS und MS/MS (LCQ) Untersuchung von Redoxreaktionen während der Aufarbeitung von Weizenmehlen Reaktionen während der Probenaufarbeitung mit Derivatisierung Einfluss des Zeitpunkts der Standardzugabe beider Probenaufarbeitung mit Derivatisierung Einfluss des phwerts während der Probenaufarbeitung ohne Derivatisierung 173

5 IV Einfluss der Standardzugabe (ohne Derivatisierung) Einfluss des phwerts bei der Standardzugabe sowie der Probenaufarbeitung (ohne Derivatisierung) Reaktionen während der Aufarbeitung mit Derivatisierung bei Standardzugabe in 5 %iger PCA Quantifizierung von GSH, GSSG, CSH und CSSC in Getreide produkten Aufarbeitung zur Quantifizierung von GSH, GSSG, CSH und CSSC in Getreideproben Aufarbeitung zur Quantifizierung von Gesamtglutathion und cystein in Getreideproben Response und Berechnung Versuche zur Bestimmung von Glutathion in Erythrozyten Partielle Oxidation Aufarbeitung Response und Berechnung Methodenvalidierung Präzision Wiederfindung Nachweis und Bestimmungsgrenzen Statistische Untersuchungen Literatur Anhang Tabellen Abbildungen 198