Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften an der Universität Konstanz. vorgelegt von Christoph Borchers

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Kornelius Falk
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1 Proteinchemische Umsetzungen in Kombination mit massenspektrometrischen Methoden zur Tertiärstrukturcharakterisierung von Proteinen - Analytische Entwicklung und Anwendung zur Aufklärung der Pharmaka-Bindung im Transportprotein P-Glykoprotein Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktors der Naturwissenschaften an der Universität Konstanz vorgelegt von Christoph Borchers Hartung-Gorre Verlag Konstanz 1996

2 Inhaltsverzeichnis 1. EINLEITUNG UND ZIELSETZUNGEN Biochemische Mechanismen der Resistenz von Tumorzellen ^ gegen zytotoxische Chemotherapeutika 1.2 Vorkommen, Struktur und pharmakologische Bedeutung der 4 P-Glykoproteine 1.3. Pharmakologische Beeinflussung der durch P-Glykoprotein 8 vermittelten Zytostatika-Vielfachresistenz 1.4. Analytische Methoden zur Strukturaufklärung von Proteinen ^ 1.5 Proteinchemische Umsetzungen zur Charakterisierung von 12 Struktur und Struktur-Funktionsbeziehungen in Proteinen Aminosäurespezifische chemische Umsetzungen zur Charakteri- 12 sierung von Oberflächentopographie und Reaktivitäten in Proteintertiärstrukturen Photoaffinitätsmarkierung zur Charakterisierung von Bindungs- ^ Strukturen in Proteinen 1.6. Massenspektrometrische Methoden zur Strukturanalyse von ^ Peptiden und Proteinen 1.7. Zielsetzungen der Arbeit ' 2. ALLGEMEINER TEIL Analytisches Konzept der Kombination von tertiärstrukturselektiven proteinchemischen Umsetzungen mit massenspektrometrischen Methoden 2.2. Massenspektrometrische Charakterisierung von chemisch modifizierten Proteinderivaten Massenspektrometrische Primärstrukturcharakterisierung von Ribonuklease A und S Charakterisierung der topographischen Selektivität der Lysin- Acetylierung von Ribonuklease A Charakterisierung der Tertiärstrukturselektivität der argininspezifischen Umsetzung von Ribonuklease A 2.3. Identifizierung von P-Glykoprotein in Membranen der Zytostatika- ^1 resistenten Zellinie CCRF-ADR Kultivierung und Membranpräparation der CCRF-Zellinie ^

3 Nachweis von P-Glykoprotein durch Westem-Blot-Analyse ^ Quantitativer Nachweis von P-Glykoprotein in der Membran- 59 präparation der Zellinie CCRF-ADR5000 durch Immunopräzipitation und Densitometrie 2.4. Photoaffinitätsmarkierung von Membranproteinen der CCRF- *>4 ADR5000-Zellen Photoaffinitätsmarkierung mit Arylazido-und Benzophenon- ^4 Dihydropyridinderivaten Immunologische Identifizierung der photoaffinitätsmarkierten ^ Proteine Charakterisierung der photoaffinitätsinduzierten Ligand-P-Glyko- 7 protein-bindung Photoaffinitätsmarkierung mit [ 3 H]Azido-Dexniguldipin Darstellung und Charakterisierung von [ 3 H]Azido-Dexniguldipin Gelelektrophoretische Charakterisierung der Photoaffinitäts- 85 markierung mit [ 3 H]Azido-Dexniguldipin Charakterisierung und immunologischer Nachweis der 87 Dexnigulipin-P-Glykoprotein-Bindung Pharmakologische Charakterisierung der Dexniguldipin-Bindungs- 92 stelle im P-Glykoprotein 2.5. Isolierung und Reinigung von photoaffinitätsmarkiertem P-Glyko- 9^ protein aus Membranpräparationen der Zellinie CCRF-ADR Solubilisierung von P-Glykoprotein Isolierung von P-Glykoprotein durch Affinitätschromatographie Reinigung des polyklonalen Antikörpers pak 909 aus 101 Kaninchenserum Affinitätschromatographie mit dem polyklonalen Antikörper 105 pak Reinigung von P-Glykoprotein durch Lektin-Chromatographie ^^ 2.6. Proteolytischer Abbau von Dexniguldipin-gebundenem P-Glyko- 119 protein nach Reinigung durch Lektin-Chromatographie 2.7. Isolierung der Dexnigulidpin-gebundenen, tryptischen Peptide ^2^ durch Dünnschicht- und Gelfiltrationschromatographie 2.8 Massenspektrometrische Identifizierung der Dexniguldipin- ^ 4 Bindungssequenz im P-Glykoprotein 10

4 3. EXPERIMENTELLER TEIL Modellproteine und Peptide 3.2. Materialien und Reagenzien Methoden zur Herstellung von CCRF-Membranen Massenkultivierung von CCRF-Zellen Zellernte und Membranpräparation von CCRF-Zellen Solubilisierung von CCRF-ADR5000-Membranen 3.4. Proteinchemische Umsetzungen Chemische Umsetzungsreaktionen Acetylierung von Aminogruppen DHCH-Modifizierung von Argininresten in der Ribonuklease A Photoaffinitätsmarkierung mit [ 3 H]Azidopin, [ 3 H]BZDC-DHP und [ 3 H]Azido-Dexniguldipin Reduzierung und Alkylierung von Cysteinresten Bromcyanabbau von affinitätsgereinigtem P-Glykoprotein Edman-Abbau von [ 3 H]Azido-Dexniguldipin-markierten, tryptischen Peptiden Enzymatische Spaltungsreaktionen "In situ" Reduktion und Endoproteaseabbau von Ribonuklease und Ribonukleasederivaten Trypsinabbau von alkylierter Ribonuklease A Tryptischer Abbau von Ribonuklease A und acetylierter Ribonuklease A in methanolischer Lösung Trypsinabbau von Membranen der CCRF-Zellen nach Photoaffinitätsmarkierung Trypsinabbau von [ 3 H]Azido-Dexniguldipin-markiertem, affinitäts- ^63 gereinigtem P-Glykoprotein 3.5. Chromatographische.Methoden Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) Hochauflösende Dünnschichtchromatographie (HPTLC) Peptidantigen Affinitätschromatographie lonenaustauschchromatographie Immunoaffinitätschromatographie, Immobilisierung des polyklonalen Antikörpers pak Affinitätschromatographie mit dem polyklonalen Antikörper pak

5 Lektin-Chromatographie 3.6. Natriumdodecyl-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 3.7. Zelluläre und immunologische Methoden ^ Colorimetrischer Zellvitaltest Rhodamin-123 Akkumulation Western-Blot-Analysen, Immunopräzipitationen Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay (ELISA) Proteinreinigung und Proteinbestimmung Ultrafiltration Dialyse Ponceau S-Test Quantitative Proteinbestimmung nach Pierce Quantifizierung der Gelbanden durch Densitometrie Methoden zur Radioaktivitätsbestimmung tritiumhaltiger Proben Szintillationsmessung Fluorographie Massenspektrometrische Methoden Fast-Atom-Bombardment-Massenspektrometrie Cf-Plasmadesorptions-Massenspektrometrie Elektrospray-Massenspektrometrie Matrixunterstützte Laserdesorptios/Ionisations-Massenspektrometrie Computer-Auswerteprogramme Zusammenfassung Literaturverzeichnis 201

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