Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen 1,4-Benzodiazepine zum empfindlichen Nachweis in biologischem Probenmaterial
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- Victor Salzmann
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1 Herstellung monoklonaler und polyklonaler Antikörper gegen 1,4-Benzodiazepine zum empfindlichen Nachweis in biologischem Probenmaterial Den naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-NOrnberg zur Erlangung des Doktorgrades vorgelegt von Ingrid Ackermann aus Weißenstadt
2 INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. Einleitung und Problemstellung l 2. Allgemeiner Teil Stand der Technik Immunologische Nachweisverfahren auf dem Gebiet der Benzodiazepinanalytik Immunadsorption in der toxikologischen Analytik, im veterinärmedizinischen Bereich sowie in der Dopingkontrolle Standardmethodik Eigenschaften vonlmmunglobulinen Immunoassays Prinzip einer Titerbestimmung (ELISA) Prinzip des Screening-ELISA Prinzip des Kompetitions-ELISA Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper Herstellung von Immunogenen Auslösen einer Immunantwort Auswahl der Tiere Gewinnung polyklonaler Antikörper Gewinnung monoklonaler Antikörper Kultivierung der Myelomazellen Blutentnahme und Titerbestimmung Milzentnahme, Zellfusion und Selektionsprinzip Auswahl antikörper-produzierenderzellklone mittels ELISA und Vereinzelung (Klonierung) Kultivierung von Hybridomen Isolierung von Antikörpern Charakterisierung von Antikörpern anhand Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 19
3 III Affinitätschromatographie und Immunadsorption Prinzip einer Immobilisierung von Protein an Glutardialdehyd-aktiviertes Aminospherosil Prinzip einer Immobilisierung von Protein an CNBr-. aktivierte Agarose Experimenteller Teil Herstellung von Antikörpern gegen Benzodiazepine Herstellung monoklonaler Antikörper Herstellung von Oxazepam-3-hemisuccinyloxy- KLH sowie Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-OVA Herstellung von Oxazepam-3-hemisuccinat Charakterisierung des Reaktionsproduktes Herstellung von Oxazepam-3-hemisuccinyloxy- KLH und Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-OVA Quantitative Bestimmung des gebundenen Oxazepam-3-hemisuccinat in Oxazepam-3- hemisuccinyloxy-klh und Oxazepam-3- hemisuccinyloxy-ova (HPLC) ; Zusammenfassung der Ergebnisse Entwicklung eines Immunoassays (ELISA) zum Nachweis von Antikörpern gegen Benzodiazepine Test von vier Antigenen auf unspezifische Bindung im ELISA Untersuchungsergebnisse Immunisierung von Mäusen und Gewinnung monoklonaler Antikörper Immunisierungen und Titerbestimmung Herstellung von Hybridomen Zellfusionierung und Klonierungen der antikörperproduzierenden Zellinien Produktion monoklonaler Antikörper in Suspensionskulturen sowie im miniperm - Bioreaktorsystem Charakterisierung der monoklonalen Antikörper Ermittlung der Kreuzreaktivitäten der monoklonalen Antikörper (Kompetitions-ELISA) Bestimmung des IgG-Subtyps der monoklonalen Antikörper Zusammenfassung der Ergebnisse Isolierung monoklonaler Antikörper Charakterisierung der erhaltenen Fraktionen Quantifizierung der Proteine und deren Identifizierung mittels Sodiumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Bestimmung des Antikörpertiters in den Fraktionen (ELISA) Zusammenfassung der Ergebnisse Herstellung polyklonaler Antikörper Herstellung von Flunitrazepam-7-azo-KLH Quantitative Bestimmung des gebundenen 7- Aminoflunitrazepam in Flunitrazepam-7-azo-KLH (HPLC) Zusammenfassung der Ergebnisse Immunisierung von Schafen, Titerbestimmung der Antiseren Ermittlung der Kreuzreaktivitäten der Antiseren (Kompetitions-ELISA) Immunadsorption Immobilisierung monoklonaler Antikörper Verwendung der Immunadsorber IA, IB und II zur Anreicherung ausgewählter Benzodiazepine aus Pufferlösungen Optimierung der Elutionsbedingungen bei der Immunadsorption Untersuchungsergebnisse Bestimmung der Oxazepam-Bindungskapazität und -Wiederfindungsrate bei Immunadsorber IA und IB 51, \
4 IV Batch-Verfahren (Immunadsorber IA) Säulenverfahren (Immunadsorber IB) Bestimmung der Benzodiazepin-Bindungskapazität und -Wiederfindungsrate bei Immunadsorber II Bindungskapazität und Wiederfindungsrate von Immunadsorber II bezüglich Oxazepam Bindungskapazität und Wiederfindungsrate von Immunadsorber II gegenüber den Metaboliten einiger niedrig dosierter Benzodiazepine Verwendung des Immunadsorbers II zur Anreicherung von Benzodiazepinen aus Patientenurin im Vergleich zu einer konventionellen Festphasenextraktionsmethode (C 18 ) Urinprobe Anreicherung von Benzodiazepinen aus Urinprobe I mittels Immunadsorption Cis -Festphasenextraktion von Benzodiazepinen aus Urinprobe Urinprobe II Anreicherung von Benzodiazepinen aus Urinprobe II mittels Immunadsorption Cio -Festphasenextraktion von Benzodiazepinen aus Urinprobe II Material und Methoden Herstellung monoklonaler Antikörper Herstellung von Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-KLH und Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-OVA Herstellung von Oxazepam-3-hemisuccinat Charakterisierung des Reaktionsprodukts DC-Untersuchungen HPLC-Untersuchungen NMR-Untersuchungen Herstellung von Oxazepam-3-hemisuccinyloxy- KLH und Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-OVA Quantitative Bestimmung des gebundenen Oxazepam in Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-KLH und Oxazepam-3-hemisuccinyloxy-OVA (HPLC) Nachweis von Antikörpern gegen Benzodiazepine mittels ELISA Entwicklung eines ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen Benzodiazepine Verwendete EUSA-Testsysteme Durchführung einer Titerbestimmung Durchführung eines Screening-ELISA Durchführung eines Kompetitions-ELISA Immunisierung von Mäusen und Antikörpertiterbestimmung Immunisierungen Blutentnahme und 5. Immunisierung Herstellung von Hybridomen ; Präparation der Milzzellen und Bestimmung der Lymphozyten-Zellzahl Zellfusionierung und Primärkultur Klonierung ; Produktion monoklonaler Antikörper in Suspensionskulturen sowie im miniperm - Bioreaktorsystem Bestimmung des Immunglobulin-Subtyps Isolierung monoklonaler Antikörper aus Kulturüberständen Immobilisierung von Anti-Maus-Fc-IgG an CNBraktivierte Agarose Isolierung monoklonaler Antikörper aus Kulturüberständen Batch-Verfahren Quantitative Bestimmung von Proteinen Charakterisierung der Fraktionen mittels Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Dialyse und Lyophilisierung 85
5 VI 4.2 Herstellung polyklonaler Antikörper Herstellung von Flunitrazepam-7-azo-KLH Quantitative Bestimmung des gebundenen 7- Aminoflunitrazepam in Flunitrazepam-7-azo-KLH (HPLC) Immunisierung von Schafen Titerbestimmung und Bestimmung der Kreuzreaktivitäten der Antiseren Immobilisierung monoklonaler Antikörper Immobilisierung der monoklonalen Antikörper M 5 an GDAaktiviertes Aminospherosil Immobilisierung der monoklonalen Antikörper M 5 an CNBraktivierte Agarose Verwendung der Immunadsorber IA, IB und II zur Anreicherung ausgewählter Benzodiazepine aus Pufferlösungen Optimierung der Elutionsbedingungen bei der Immunadsorption Bestimmung der Oxazepam-Bindungskapazität und - Wiederfindungsrate bei Immunadsorber IA und IB Immunadsorber IA (Batch-Verfahren) Immunadsorber IB (Säulen-Verfahren) Bestimmung der Benzodiazepin-Bindungskapazität und -Wiederfindungsrate bei Immunadsorber II Verwendung des Immunadsorbers II zur Anreicherung von Benzodiazepinen aus Patientenurin im Vergleich zu einer konventionellen Festphasenextraktionsmethode (Cis) Anreicherung von Benzodiazepinen aus Urinproben mittels Immunadsorption Cis-Festphasenextraktion von Benzodiazepinen aus Urinproben Diskussion Zusammenfassung Literaturverzeichnis 108 Anhang 116
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