(Fermentation), Reinigung, Markierung Hybridom-Technik

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Julia Kalb
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1 Immunisierung, Antikörperproduktion (Fermentation), Reinigung, Markierung Hybridom-Technik Universit ität Pécs, Medizinische Fakul ultät Institut für Immunologie und Biotechnologie ie

2 Monoklonale Antikörper: werden von einer auf einen einzigen B-Lymphozyten B zurückgehenden Zelllinie (Zellklon) produziert und richten sich gegen ein einzelnes Epitop. Polyklonale Antikörper: rper: Es handelt sich um ein Gemisch mehrerer verschiedener Antikörper unterschiedlicher Spezifität,, die verschiedene Epitope eines bestimmten Antigens erkennen und daran binden.

Polyklonale Antikörper: rper: Es handelt sich um ein Gemisch mehrerer verschiedener

3 Antikörper erkennen einzelne Epitope (Antigendeterminante)

4 Das komplexe Antigen löst eine polyklonale Immunantwort aus, die zur Bildung verschiedener Antikörper führt

5 Immunisierung 1. Auswahl des geigneten Tieres: Monoklonaler Antikörper Maus oder Ratte Polyklonaler Antikörper Kaninchen, Schaf, Ziege Antigen: Hapten (5-10 kd >) Träger native / modifizierte Moleküle (Gabe: muskulär, subkutan oder intrakutan) oder Zellen (Gabe: iv. oder ip.)

Ratte Polyklonaler Antikörper Kaninchen, Schaf, Ziege Antigen:

6 Immunisierung

7 Das Antigen (der Carrier-Hapten-Komplex) induziert die Bildung von Antikörpern mit unterschiedlicher Spezifität Antigen (Träger + Hapten) ANTIKÖRPER Träg erspezifische AK Haptenspe zifische AK Träger + Haptenspe zifisc he AK

Spezifität Antigen (Träger + Hapten) ANTIKÖRPER Träg

8 Immunisierung 2. Adjuvant (Hilfsmittel): (Hilfsmittel): verlangsamen die Aufnahme des Antigens und verursachen die unspezifische Stimulierung des Immunsystems (Makrophagenaktivierung( Makrophagenaktivierung) Am häufigsten h gebraucht: inkompletter Adjuvant, auf Mineralöl-Basis, (z.b.: inkomplett: Hegedűs,, Freund) Kompletter Freund Adjuvant: : abgetötetes tetes Mycobacterium tuberculosis in Mineralöl-Emulsion Aluminium-Hydroxid Gel Muramil-Dipeptide (Mycobacterium tuberculosis ) Bakterielle Impfstoffe stoffe,, die gleichzeitig gegeben werden, erhöhen hen die Antikörperproduktion gegen das Immunogen z.b.: Bordatella pertussis Liposomen

(Makrophagenaktivierung( Makrophagenaktivierung) Am häufigsten h gebr

9 Kinetik der Antikörperproduktion

10 Antikörperreinigung 1. Antikörper werden als Serum aus Tieren gewonnen. Klärung rung: IgM: Gewinnung der Ig-Fraktion mit chemischen Methoden: auf Molekülgewicht lgewicht und Löslichkeit basierend Gewinnung bei niedriger Ionkonzentration ( euglobulin precipitation ) Wir können k reinere ere Ausflockung erhalten, wenn wir Borsäuredyalisis anwenden Weitere Reinigung mit Gelchromatographie Konzentrationsgradienten en-zentrifugierung

Löslichkeit basierend Gewinnung bei niedriger Ionkonzentration ( euglobulin precipitation ) Wir können k

11 Antikörperreinigung 2. IgG: bei ph 6.4 wird sich nach der Zugabe von 1.39 M (NH 4 ) 2 SO 4 niederschlagen Nach dem Niederschlag mit Rivanol bleibt das IgG und das Transferrin in gelöster Form, der andere Proteinbestandteil scheidet sich aus Ionaustauschchromatographie Affinitätschromatographie tschromatographie (Staphylococcus aureus Protein A, Streptococcus Protein G)

Transferrin in gelöster Form, der andere Proteinbestandteil scheidet sich aus

12 Antikörperreinigung 3. IgA,, D, E: Methoden in mehreren Schritten IgA: nach Ausflockung mit Zn; Ionaustauschchromatographie und Gelfiltration IgE: Affinitätschromatographie tschromatographie mit ConA Immunosorbente Methoden: spezifische Antigenisolierung isolierung auf der Oberfläche des Sepharose-,, Zellulose- oder Polyacrylamidegels

Ionaustauschchromatographie und Gelfiltration IgE: Affinitätschromatographie

13 Antikörper rper-testung Die Prüfung des Titers und der Spezifizität sollte im gleichen System durchgeführt hrt werden, in dem der Antikörper aufgetragen wird. z.b.:.: ELISA Durchflusszytometrie Immunohistochemie

durchgeführt hrt werden, in dem der Antikörper

14 Hybridomtechnik Cesar Milstein 1985: Nobel-Pr Preis Georges Koehler

15 Hybridomtechnik, Produzierung des monoklonalen Antikörpers Def.: Mit der Hybridomtechnik können spezifische aktivierte Immunzellen mit begrenzter Lebenserwartung zur Antikörperproduktion ausgewählt werden, in vitro für r unbeschränkte nkte Zeitdauer am Leben gehalten und zur Proliferation fähig gemacht werden Die Grundlage der Technik ist, dass wir in vitro eine aktivierte Immunzelle mit einer Tumorzelle fusionieren (vereinigen) lassen.

Antikörperproduktion ausgewählt werden, in vitro für r unbeschränkte nkte Zeitdauer am Leben gehalten und zur

16 Myelome Plasmazelle Unsterblichkeit Antikörperproduktion Hybridome unsterbliche, Antikörperproduzierende Zellen

17 Hybridomproduktion Zellfusionierung: Milzzelle (von immunisiertem Tier) + unsezernierte Mausmyelomzelle (Sp-2/0 2/0-Ag14) + PEG 2. Selektion: Selektion des gewünschten Hybride (Milzzelle Myeloma) HGPRT- und TK-Enzyme (Synthesis von Purin und Pyrimidin) ) fehlen in den Sp-2 2 Zellen, aber die Milzzellen verfügen über sie, so können k wir durch den Gebrauch von einem selektiven Nährmedium N (HAT) die Milzzelle - Sp2 Hybriden auswählen. HGPRT: Hypoxanthine-guanine phosphorybosil transferase TK: Thymidine Kinase HAT: Hypoxanthin-Aminopterin Aminopterin-Thymidine

2 Zellen, aber die Milzzellen verfügen über sie, so können k wir durch den Gebrauch von einem selektiven Nährmedium N (HAT) die Milzzelle -

18 Hybridomproduktion Auswählen der Hybridkulturen, die Antikörper produzieren 4. Die Antikörperproduktion kann mit ELISA getestet werden 5. Klonen: Verdünnung der Antikörper produzierenden Zellen auf einer 96 well-platte so, dass in ein Well nur eine einzige Zelle kommt. 6. Wiederholtes Testen der Antikörperproduktion der Monoklonen, der Antikörper rper, die durch einen einzelnen Klon der Zellen produziert werden (monoklonale Antikörper rper). 7. Antikörperproduktion in großer Menge: : (1) Produktion des Hybridomsupernatantes in vitro; (2) Gabe der Hybridomzellen ip. in Maus; ; (3) Fermentor.

Wiederholtes Testen der Antikörperproduktion der Monoklonen, der Antikörper rper, die durch einen einzelnen Klon der Zellen produziert werden

19 Schritte der Hybridom- produktion

21 Anwendung der monoklonalen Antikörper Moderne Routinemethoden der Labordiagnostik Immunhistochemishe Methoden: Markierung (CD) und Lokalisierung der Lymphozytenuntergruppen (Blut, Gewebe), Tumordiagnostische Zwecke Durchflusszytometrie (FACS) Proteinreinigung In vivo Tumor- und Immuntherapie

22 Humanisierte Antikörper 1. Therapeutische monoklonale Antikörper Die verwendeten Antikörper der Maus (murine Antikörper rper, Endung: -omab) wirken im menschlichen Organismus selbst als Antigen und können eine gegen sie gerichtete Immunantwort auslösen sen (HAMA= Human Antimaus- Antikörper rper). Modifizierte Antikörper für die therapeutische Anwendung Es ist in den letzten Jahren gelungen, modifizierte, den menschlichen Antikörpern besser angepasste monoklonale Antikörper zu entwickeln.

23 Humanisierte Antikörper Fab CDR Fc CDR= Hypervariable Region (Abschnitt)

24 Therapeutische Anwendungen von humanisierten Antikörpern Immunsuppression bei Organtransplantation Entfernung von aktivierten T-Zellen (a-cd3, a- CD25) Lymphomatherapie a-cd20 Immunsuppression bei Autoimmunkrankheiten a-tnfα

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