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1 Sächsische Landesbibliothek - Staats- und Universitätsbibliothek Dresden (SLUB) Zweigbibliothek Medizin Diese Hochschulschrift finden Sie original in Printform zur Ausleihe in der Zweigbibliothek Medizin Nähere Angaben zu Standort, Öffnungszeiten usw. finden Sie auf der Homepage der SLUB. Auf den folgenden Seiten finden Sie * Titelblatt und Inhaltsverzeichnis der Hochschulschrift.

2 UNTERSUCHUNG ZUR CHARAKTERISIERUNG DER SPLA2IIA IN HUMANEN BLUTPLATTCHEN DISSERTATIONSSCHRIFT ZUR ERLANGUNG EINES DOCTOR MEDICINAE (DR. MED) DER MEDIZINISCHEN FAKULTÄT CARL GUSTAV CARUS DER TECHNISCHEN UNIVERSITÄT DRESDEN VORGELEGT VON JOACHIM STEINERT AUS CHEMNITZ DRESDEN 2009

3 Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis vii Abbildungsverzeichnis ix Tabellenverzeichnis xii 1. Einleitung 1 2. Theoretische Grundlagen Phospholipasen 2.2 Klassifikation und Funktion der PLA Vorkommen der spla 2 IIA 2.4 Phospholipide als Substrat der Phospholipase 2.5 Eigenschaften und biologische Funktionen der SPLA2IIA 2.6 spla 2 und Gerinnung 2.7 Thrombozyten und spla Aktuelle Forschung zur spla 2 IIA Arteriosklerose Bakterizide Eigenschaften Antiinflammatorische Bedeutung 3. Material und Methoden Erfassung der Konzentration von spla 2 IIA in humanen Plättchen zweier unterschiedlicher Probandengruppen Probanden Arbeitsvorlage zur spla2-bestimmung 111

4 Herstellung einer Standardproteinlösung auf NaCl(0,9%) Basis Die Vorbereitung des Bicinchoninic acid protein assay kit (BCA- Kit) / SIGMA Präparation einer Vollblutprobe zur PAI-, Protein- und SPLA2- Bestimmung Proteinbestimrnung im Thrombozytenlysat Bestimmung des PAI im Thrombozytenlysat Bestimmung der SPLA2IIA im Thombozytenlysat 3.2 Erfassung der auf der Thrombozytenoberfläche exprimierten spla 2 IIA bei zwei definierten Probandengruppen Arbeitsvorlage zur FACS-Analyse der Thrombozyten Thrombozytenpreparation wie unter Herstellung der spla 2 IIA-AK und CD62P-AK-Gebrauchslösung FACS-Analyse der Thrombozyten 3.3 Fluorometrische Bestimmung der spla 2 IIA-Aktivität an der Thrombozytenoberfläche Probenmaterial Methode zur fluorometrischen spla2-bestimmung Preparation des Assay-Puffers Pyren-Decansäure PPyrPG Vorbereitungen zur Anwendung des Assays auf Mikrotiterplatten Versuchsdurchführung Fluoreszenz und der Einfluss von Quenching auf die erhobenen Messwerte Fluoreszenzmikroskopie mit PPyrPG versetzter Thrombozyten 4. Ergebnisdarstellung spla 2 IIA-Bestimmung im Thrombozytenlysat und deren Korrellation mit PAI sowie zur Proteinmenge im Thrombozytenlysat 4.2 FACS-Analyse der spla 2 IIA-Expression auf der Zelloberfläche aktivierter Thrombozyten IV

5 4.3 Fluorometrische Bestimmung der spla 2 IIA-Aktivität auf Thrombozytenoberflächen vor und nach Blutplättchenaktivierung 5. Diskussion Auswertung der spla 2 IIA-Bestimmung im Blutplasma und Thrombozytenlysat Vergleich zwischen den spla2lia-konzentrationen für gesunde männliche Probanden und männliche Patienten mit CRP > 98mg/l Relation der splazha-konzentration in Blutplasma und Thrombozytenlysat 5.2 Bestimmung der spla 2 IIA-Expression auf Thrombozyten mit Hilfe der FACS-Analyse FACS-Analyse für Thrombozyten gesunder männlicher Probanden nach Thrombinstimulation FACS-Analyse für Thrombozyten männlicher Probanden mit CRP > 98mg/l nach Thrombinstimulation 5.3 Fluorometrische Bestimmung der SPLA2IIA-Aktivität auf der Thrombozytenoberfläche Nachweis der spla 2 IIA-Aktivität Beobachtung der katalytischen splajiia-aktivität im Intervall von 10min Betrachtungen über den Einfluß der Thrombozyten auf die Fluoreszenzintensität, sowie dessen Neutralisierung durch OGP(noctyl-ß-D-Glycopyranosid) 6. Zusammenfassung 70 Quellenangaben 72 Thesen 85

6 Eidesstattliche Erklärung 87 Danksagung 88 Anhang 89 VI

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