Der Experimentator: Immunologie

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1 Werner Luttmann Kai Bratke Michael Küpper Daniel Myrtek Der Experimentator: Immunologie 4., vollständig überarbeitete und korrigierte Auflage Springer Spektrum

2 Inhaltsverzeichnis 1 Antikörper Des Antikörpers Eigenheiten Molekülstruktur von Antikörpern Die Antigen-Antikörper-Bindung Herstellung von Antikörpern Das Antigen Die Wahl der Spezies Antigenapplikation Polyklonale Antikörper Monoklonale Antikörper Rekombinante Antikörper Reinigung von Antikörpern »Quick and dirty«- Präzipitationsmethoden Affinitätschromatographie Klassische Methoden der Proteinreinigung Aufreinigung von IgY aus Eigelb Aufreinigung rekombinanter Antikörper Wichtige analytische Techniken Chemische Kopplung und Markierung von Antikörpern Chemische Kopplung von Antikörpern an feste Phasen Kopplung von Markerenzymen an Antikörper Kopplung von Fluorochromen an Antikörper Kopplung von Biotin Markierung mit Gold Markierung mit radioaktiven Isotopen Antikörper-Mikroarray 46 Weiterführende Literatur 49 2 Zellseparation Trennung nach Zellgröße und Zelldichte - Zentrifugationstechniken :1 Differenzialzentrifugation Dichtegradienten-Zentrifugation Separationsmedien Gegenstromzentrifugation Trennung nach zellspezifischen Oberflächenmolekülen Adhäsion an Kunststoffoberflächen Adhäsion an Nylonwatte Erythrocyten-Rosettierung Immunmagnetische Separation Lysierende Antikörper 70 Weiterführende Literatur 71 3; Durchflusscytometrie Wie funktioniert das eigentlich? Fluoreszenzen 78

3 Inhaltsverzeichnis 3.3 Probenvorbereitung Zellmarkierung Inbetriebnahme des Durchflusscytometers Kompensation und Messung Kompensation Messung Auswertung Histogramm-Plot Dot-Plot Dichteplot Konturplot Isometrische Darstellung Modelle und Ausstattungen Autosampier Zellsorter Vergleichbarkeit durchflusscytometrischer Daten 100 Weiterführende Literatur Quantitative Immunoassays Assaykonzepte Der kompetitive Assay Der Sandwich-Assay Welches Assaykonzept für welche Anwendung? Radioimmunoassay (RIA) Historisches Praktisches Enzyme-Iinked Immunosorbent Assay (ELISA) Coaten, Blocken, Waschen Enzyme und Substrate ELISA in der Praxis ELISPOT-Assay Anwendung und Vergleich mit anderen Methoden Prinzip und Praxis Partikel-Immunoassay (PIA) Prinzip der Mini-Kugeln Trapping-Assay > Multiplex-Assa?" Vergleich mit anderen Immunoassays Verstärkersysteme Erhöhung der Markerdichte , Multi-Enzym-Kaskaden Immuno-PCR 127 Weiterführende Literatur Western-Blot., Probenvorbereitung Auftrennung eines Proteingemisches mittels Gelelektrophorese Die diskontinuierliche SDS-PAGE Native Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung 139

4 'xi;- Inhaltsverzeichnis» H 5.3 Transfer der Proteine auf eine Membran (Blot) Wet-Blot Semi-Dry-Blot Fehlerquellen 5.4 Proteindetektion Blocking Antikörpermarkierung Visualisierung 5.4.4»Stripping«und»Re-probing«von Western-Blot-Membranen Fehlerquellen und Kontrollen 5.5 Dot- und Slot-Blot Weiterführende Literatur in situ-lmmunlokalisation 6.1 Untersuchung von Zellsuspensionen Zellsuspensionen Cytospins Zellausstriche Einbettung von Zellen Variationen und Details zur Behandlung von Zellsuspensionen 6.2 Untersuchung von Geweben Vorbereitung Fixierung Paraffin-Einbettung Schneiden Nachbehandlung Immundetektion Eindeckung 6.3 Immunelektronenmikroskopische Untersuchung von Geweben Fixierung : Einbettung Mikrotomie Immundetektion 6.4 Tissue Microarrays Weiterführende Literatur Immunpräzipitation 7.V. Die Klassiker Eindimensionale Immundiffusion Zweidimensionale Immundiffusion nach Ouchterlony Radiale Immundiffusion nach Mancini Immunelektrophoresen : Limitierung und aktuelle Bedeutung 7.2 Immunpräzipitation»heute«7.2.1 Die Präzipitationsmatrix Reduktion unspezifisch präzipitierender Proteine.' Analyse der Immunpräzipitate Weiterführende Literatur

5 XII Inhaltsverzeichnis 8 Die Zelle: leben, fressen, sterben Zellviabilitätsbestimmung Farbstoff-Exklusion Tetrazoliumsalz-Reduktion ATP-Assay Zellproliferation DNA-Markierung mit [ 3 H]Thymidin DNA-Markierung mit 5-Brom-2'-desoxyuridin (Brdü) Durchflusscytometrische Bestimmung der Zellproliferation Phagocytose-Assays Die Testpartikel- Futter für die Phagocyten Methoden der Partikelvisualisierung Zellvermittelte Cytotoxizität Chrom[ 51 Cr]-release-Assay Lactat-Dehydrogenase(LDH)-release-Assay DurchflusscytometrischerCytotoxizitätsnachweis Apoptose-Assays Färbungen des Zellkerns DNA-Leiter Nudeosomen-Quantifizierungs-ELISA TUNEL-Technik Annexin V Messung von Caspase-Aktivität Sonstiges 219 Weiterführende Literatur Immunologie in der klinischen Anwendung Blutgruppenbestimmung HLA-Typisierung Lymphocytotoxizitätstest Lymphoblastentransformation Immunzellen in der Therapie Dendritische Zellen 232 Weiterführende Literatur 236 i 10 Ein kurzer Ausflug in die ungeliebte Welt der Statistik Deskriptive Statistik Lokationsmaße Streuungsmaße Korrelationsmaße Prüfstatistik Skalen und ihre Daten : Skizze des Ablaufs einer wissenschaftlichen Untersuchung :2.3 Die Wahl eines geeigneten Signifikanztests 249 Weiterführende Literatur 254

6 Inhaltsverzeichnis XIII 11 Naturwissenschaft vs. Übernatürliches 255 CD-Antigene, Cytokine, Chemokine 257 Glossar 281 Index 293