Michael Schleeger Funktionsstudien der Cytochrom c Oxidase mit Hilfe von stationärer Differenz- und zeitaufgelöster FT-IR-Spektroskopie

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3 Berichte aus der Biophysik Michael Schleeger Funktionsstudien der Cytochrom c Oxidase mit Hilfe von stationärer Differenz- und zeitaufgelöster FT-IR-Spektroskopie Shaker Verlag Aachen 2009

4 Bibliografische Information der Deutschen Nationalbibliothek Die Deutsche Nationalbibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Zugl.: Bielefeld, Univ., Diss., 2009 Copyright Shaker Verlag 2009 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN ISSN Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet: info@shaker.de

5 It has only recently been recognized that catalytic oxidation in living substances rests upon change of valency in an iron compound which is the respiratory oxygentransferring ferment. (Auszug aus der Nobelpreis-Rede von Otto Warburg, Nobelpreis für Medizin oder Physiologie 1931 für die Entdeckung der Natur und Funktion des Atmungsferments )

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7 Inhalt 1 Inhaltsverzeichnis 1 ZUSAMMENFASSUNG EINLEITUNG Die Bioenergetik Energieumsatz und biologische Energie Die Atmungskette Die Enzymfamilie der Häm-Kupfer Oxidasen Die Struktur und Funktion der Cytochrom c Oxidase Die Quartärstruktur und die redoxaktiven Kofaktoren Der Reaktionszyklus der Cytochrom c Oxidase Spektroskopische Untersuchungen des Mechanismus der Cytochrom c Oxidase FT-IR-Spektroskopie Zeitaufgelöste FT-IR-Spektroskopie mit der Step-Scan-Methode Infrarot-Spektroskopie von Proteinen und Anwendung der Differenzspektroskopie FT-IR-Messungen mit abgeschwächter Totalreflexion Das UV/VIS-Spektrum von Cytochromen MATERIAL UND METHODEN Material UV/VIS-Spektrometer FT-IR-Spektrometer IFS 66v/S ATR-Durchflusszelle mit UV/VIS-Reflexionseinheit IR-A-LED Mikromischer für die Infrarotspektroskopie Infrarot-Strahlkondenser Methoden Überexpression und Aufreinigung der CcO aus Rhodobacter sphaeroides Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Isolierung des Häm a aus CcO Probenvorbereitung für die ATR/FT-IR-Spektroskopie UV/VIS-Spektroskopie von Protein-Lösungen UV/VIS-spektroskopische Untersuchungen zur Generierung des P M -Zustandes der CcO UV/VIS-Reflexionsspektren von CcO-Proteinfilmen Stopped-Flow Messungen der Enzymkinetik von CcO Kinetik-Messungen unter naher Infrarot-Strahlung ATR/FT-IR-Absorptionsmessungen R 4 -minus-o und P M -minus-o ATR/FT-IR-Differenzexperimente Aufbau eines zeitaufgelösten Flow-Flash FT-IR-spektroskopischen Experiments Flow-Flash -FT-IR-Experimente zur Photodissoziation von Carbonyl-Myoglobin Flow-Flash -FT-IR-Experimente der Dissoziation des Carbonyl-Komplexes der CcO... 65

8 2 Inhalt 4 ERGEBNISSE Überexpression, Aufreinigung und Kontrolle des Reinheitsgrades der CcO Ausbeuten der Überexpression und Aufreinigung Proteinanalyse mittels PAGE Konzentrationsbestimmung mittels UV/VIS-Spektroskopie Kontrolle des Reinheitsgerades der CcO UV/VIS-spektroskopische Untersuchungen zur Generierung des P M -Zustandes der CcO Generierung des P M -Intermediats von solubilisierter CcO UV/VIS-Kinetikmessungen der CcO-Katalyse mittels Stopped-Flow Stopped-Flow-Kinetiken Untersuchung des Einflusses von IR-A-Strahlung auf die CcO-Kinetik FT-IR-Absorptionsspektren und Probenkontrolle FT-IR-Absorptionsspektren ATR/FT-IR-Differenzspektroskopie an Cytochrom c Oxidase-Filmen R 4 -minus-o Differenzspektren P M -minus-o ATR/FT-IR-Differenzspektren Analyse der C=O-Valenzschwingung der Glutaminsäure UV/VIS-Kontrolle der Intermediat-Bildung Zusammenfassung der ATR/FT-IR-Differenzspektren Step-Scan FT-IR-Differenzspektroskopie im Durchfluss Flow-Flash-Experimente mit Step-Scan FT-IR-Detektion an Carbonyl-Myoglobin Flow-Flash Experimente mit Step-Scan FT-IR-Detektion an der Cytochrom c Oxidase DISKUSSION ANHANG Literaturverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Absorptionskoeffizienten Baupläne und Rechnungen Bauplan der Spritzenpumpe Bauplan der Durchflusszelle für die ATR-Zelle Die Michaelis-Menten-Gleichung und ihre Lösung Berechnung der Cytochrom c Konzentration im Gemisch