Charakterisierung der pulmonalen Pharmakokinetik von Salmeterol und Insulin-like Growth Factor-1

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1 Charakterisierung der pulmonalen Pharmakokinetik von Salmeterol und Insulin-like Growth Factor-1 Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Frederic Vollmers aus Tübingen Würzburg

2 Inhaltsverzeichnis A Einleitung 23 1 Die menschliche Lunge Anatomie der menschlichen Lunge Bronchioalveoläre Flüssigkeit Erkrankungen der Lunge Chronisch obstruktive Lungenerkrankung Asthma bronchiale Die Lunge als Eintrittsort in den systemischen Kreislauf Wege über das Lungenepithel Vesikulärer Transport Clathrin-abhängige Endozytose Caveolae-abhängige Transzytose RhoA-GTPase-abhängige Endozytose Dynamin-unabhängige Endozytose Makropinozytose und Phagozytose Transport über Transportproteine 37 2 Methoden zur Untersuchung der Pharmakokinetik von pulmonal applizierten Substanzen In vitro Modelle Ex vivo Lungenperfusionsmodell In vivo Modelle Zusammenfassung 42 3 Zielsetzung der Arbeit 43 B Allgemeiner Teil 47 1 Untersuchung der pulmonalen Pharmakokinetik von Salmeterol mithilfe des humanen Lungenperfusionsmodells Hintergrund Charakteristika des Salmeterols Zielsetzung 53 11

3 1.4 Durchführung der Lungenperfusionsversuche Durchführung der Stabilitätsuntersuchungen von Salmeterol in Perfusionsflüssigkeit Ergebnisse Pulmonale Absorption von Salmeterol im Lungenperfusionsmodell Stabilität von Salmeterol in der Perfusionsflüssigkeit Diskussion Zusammenfassung 60 2 Untersuchung der pulmonalen Pharmakokinetik von IGF-1 in vitro Hintergrund Bronchialepithelzelllinie Calu Qualifikation der Zellmonolayer Hintergrund Überprüfung der Monolayerqualität durch Messen des TEER Durchführung Ergebnisse Überprüfung der Monolayerqualität durch Messung der Fluoreszeinpermeation Durchführung Ergebnisse Überprüfung der Monolayerqualität durch Markierung der Tight Junctions Durchführung Ergebnis Diskussion Transepithelialer Widerstand Permeationversuche mit Fluoreszein Ausbildung der Tight Junctions Zusammenfassung 71 12

4 2.4 In vitro Transportversuche auf porösen Filtersystemen Prinzip der Bestimmung Transportversuche mit IGF-1 und Insulin in Vollmedium Hintergrund Zielsetzung Durchführung Ergebnisse Stabilität der Proteine während der Permeationsversuche Permeationseigenschaften von Insulin und IGF Einfluss der Proteine auf die Tight Junctions Transportversuche mit Hemmstoffen der Transzytose/Endozytose Hintergund Zielsetzung Durchführung Ergebnisse Diskussion der in Vollmedium durchgeführten in vitro Studien Permeationseigenschaften von IGF-1 im Vergleich zu Insulin Transportwege des IGF-1 durch Calu-3 Zellen Mechanismus der endozytotischen Aufnahme von IGF-1 in Calu-3 Zellen Mögliche Rezeptorbeteiligung an der zellulären Aufnahme des IGF-1 in Calu-3 Zellen Transportversuche in bronchioalveolärer Lavage Hintergrund Zielsetzung Durchführung der Transportversuche in bronchioalveolärer Lavage Ergebnisse 84 13

5 Stabilität von IGF-1 in der Donorlösung Permeation von IGF-1 in bronchioalveolärer Lavage Einfluss der bronchioalveolären Lavage auf die Tight Junctions Diskussion Zusammenfassung der in vitro Studien 88 3 Untersuchungen der pulmonalen Pharmakokinetik von IGF-1 mithilfe des humanen Lungenperfusionsmodells Hintergrund Zielsetzung Durchführung der Lungenperfusionsversuche mit IGF Durchführung der Stabilitätsuntersuchung von IGF-1 in Perfusionsflüssigkeit Ergebnisse Pulmonale Absorption von IGF-1 im Lungenperfusionsmodell Stabilität von IGF-1 in der Perfusionsflüssigkeit Freisetzung von IGF-1 aus Fibroinpartikeln in humaner bronchioalveolärer Lavage Hintergrund Zielsetzung Durchführung der Freisetzungsversuche von IGF-1 aus Fibroinpartikeln in bronchioalveolärer Lavage Ergebnisse Diskussion Zusammenfassung 99 C Experimenteller Teil Untersuchung der pulmonalen Pharmakokinetik von Salmeterol und IGF-1 mithilfe des humanen Lungenperfusionsmodells Reagenzien, Geräte und Materialien Substanzen Perfusionspuffer

6 1.1.3 Humanes Gewebe Sonstige Geräte und Materialen Aufbau des Lungenperfusionsmodells Systemvorbereitungen und Präparation des Lungenlappens Durchführung der Perfusionsversuche mit Salmeterol Charakteristika der verwendeten Lungenlappen und Lungenflügel Beatmung und Perfusion Substanzlösungen von Salmeterol und L-Carnitin Applikation von Salmeterol und L-Carnitin Applikation von Salmeterol Applikation von L-Carnitin und anschließende Applikation von Salmeterol Probengewinnung Bestimmung der tatsächlich applizierten Dosis von Salmeterol Bestimmung der Konzentration der Applikationslösung Bestimmung der Restdosis im Vernebier Bestimmung der an Spacer und Verbindungsstücken haftenden Menge Salmeterol Stabilität von Salmeterol in Perfusionsflüssigkeit Quantitative Analyse der Perfusionsversuche mit Salmeterol Kalibrierstandards Kalibrierstandards aus Perfusionsflüssigkeit Kalibrierstandards aus 50 % Wasser/Methanol Probenaufarbeitung aus Perfusionsflüssigkeit LC MS/MS System Quantifizierung Validierung der Methode zur quantitativen Analyse von Salmeterol Linearität

7 1.5.2 Präzision und Richtigkeit Bestimmungsgrenze (LLOQ) Wiederfindung Durchführung der Lungenperfusionen mit IGF Charakteristika der verwendeten Lungenlappen und Lungenflügel Beatmung und Perfusion IGF-1-Partikel Applikation der Partikel Probengewinnung Bestimmung der tatsächlich applizierten Dosis von IGF Bestimmung der in den Applikator gegebenen Menge IGF Bestimmung der in der Applikationsvorrichtung haftenden Menge IGF Bestimmung der an den Verbindungstücken haftenden Menge IGF Stabilität von IGF-1 in der Perfusionsflüssigkeit Freisetzung von IGF-1 aus Fibroinpartikeln in bronchioalveolärer Lavage Bronchioalveoläre Lavage Konzentrierung der bronchioalveolären Lavage Durchführung der Freisetzungsversuche Untersuchen der pulmonalen Pharmakokinetik von IGF-1 in vitro Materialien Reagenzien Sonstige Geräte und Materialien Zellkultur Routinearbeiten in der Zellkultur Kultivierung

8 2.2.2 Passagieren Einfrieren und Auftauen Zellzählung Kultivierung der Calu-3 Zellen auf porösen Filtern Aufbau des Permeationsmodells Aussaat der Zellen auf poröse Filter Qualifizierung der Monolayer Messung des transepithelialen elektrischen Widerstandes Permeation mit Fluoreszein Berechnung des Permeationskoeffizienten Markierung der Tight Junctions Zusammenfassung der Qualitätsuntersuchungen und Vorbehandlung der Monolayer für Transportversuche Transportversuche mit IGF-1 in Vollmedium Lösungen Durchführung der Versuche Einfluss von IGF-1 in Vollmedium auf die Tight Junctions Stabilität von IGF-1 während der Transportversuche Transportversuche mit IGF-1 und Hemmsubstanzen der Transzytose Hemmstoffe Lösungen Durchführung Transportversuche mit IGF-1 in bronchioalveolärer Lavage Bronchioalveoläre Lavage Konzentrierung der bronchioalveolären Lavage Lösungen Durchführung der Transportversuche Einfluss der bronchioalveolären Lavage auf die Tight Junctions

9 2.7.6 Stabilität von IGF-1 während der Transportversuche Transportversuche mit Insulin in Vollmedium Lösungen Durchführung der Versuche Einfluss von Insulin in Vollmedium auf die Tight Junctions Stabilität von Insulin während der Transportversuche Analytik von IGF-1, Insulin und Fluoreszein Quantitative Bestimmung von IGF Proben aus den in vitro Versuchen Proben aus den Lungenperfusions- und Freisetzungsversuchen Durchführung des Elisa zur Bestimmung des IGF Quantitative Bestimmung von Insulin Proben aus den in vitro Versuchen Durchführung des Elisa zur Bestimmung des Insulin Auswertung der Elisas Quantitative Bestimmung von Fluoreszein 149 D Tabellarischer Anhang Untersuchung der pulmonalen Pharmakokinetik von Salmeterol mithilfe des Lungenperfusionsmodells Tatsächlich applizierte Dosis von Salmeterol in den Lungenperfusionsversuchen Ergebnisse der Lungenperfusionsversuche mit alleiniger Salmeterol Applikation Ergebnisse der Lungenperfusionsversuche mit L-Carnitin/Salmeterol Applikation Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchung von Salmeterol in der Perfusionsflüssigkeit Untersuchung der pulmonalen Pharmakokinetik von IGF-1 in vitro Ergebnisse der Qualitätsüberprüfungen TEER Werte der 21 tägigen Messung

10 2.1.2 Fluoreszeinpermeationen Markierung der Tight Junctions Ergebnisse der Permeationen durch Calu-3 Zellen in Vollmedium Permeationen mit IGF-1 in Vollmedium Einfluss von IGF-1 in Vollmedium auf die Tight Junctions Permeationen von Insulin in Vollmedium Einfluss von Insulin in Vollmedium auf die Tight Junctions Stabilität von IGF-1 und Insulin im Permeationsmedium Ergebnisse der Permeation von IGF-1 in Vollmedium mit Hemmstoffen der T ranszytose/endozytose Permeation mit Inhibitor Nocodazol Permeation mit Inhibitor Dynasore Permeation mit Inhibitor Phenylarsinoxid Permeation mit Inhibitor Amilorid Permeation mit Inhibitor Amantadin Permeation mit Inhibitor Indometacin Mittelwert der Konzentrationen von IGF-1 in den Donorlösungen mit Vollmedium Ergebnisse der Permeationen in BAL Permeation von IGF-1 in BAL als Donorlösung Permeation von IGF-1 in Vollmedium (Kontrolle) als Donorlösung Permeation von IGF-1 in BAL mit Hemmstoffen der Transzytose/Endozytose Permeation mit Hemmstoff Nocodazol Permeation mit Hemmstoff Dynasore Mittelwert der Konzentrationen von IGF-1 in Donorlösungen mit BAL Einfluss von IGF-1 in BAL auf die Tight Junctions

11 TEER Werte vor und nach der Permeation Fluoreszeinpermeation nach der Permeation von IGF-1/BAL Fluoreszeinpermeation nach der Permeation von IGF-1/Vollmedium Stabilität von IGF-1 in BAL-Donorlösung Untersuchung der pulmonalen Pharmakokinetik von IGF-1 mithilfe des Lungenperfusionsmodells Tatsächlich applizierte Dosis von IGF-1 in den Lungenperfusionsversuchen Ergebnisse der Lungenperfusionsversuche mit IGF-1/Trehalose Applikation Ergebnisse der Lungenperfusionsversuche mit IGF-1/Fibroin Applikation Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen von IGF-1 in Perfusionsflüssigkeit Ergebnisse der Freisetzungversuche von IGF-1/Fibroin-Partikeln 188 E Zusammenfassung Zusammenfassung Summary 196 ^ F Abkürzungsverzeichnis 199 G Literaturverzeichnis