Isolierung und Charakterisierung der Proteinkörpermembran aus Clycine max und deren Wechselwirkung mit dem pflanzeneigenen Lectin

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1 S Isolierung und Charakterisierung der Proteinkörpermembran aus Clycine max und deren Wechselwirkung mit dem pflanzeneigenen Lectin Dissertation zur Erlangung des naturwissenschaftlichen Doktorgrades der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität Würzburg vorgelegt von Gunter Schecher aus Schweinfurt Würzburg 1996

2 Inhaltsverzeichnis Seite Abkürzungsverzeichnis 7 A. Einleitung 10 B. Lectine in den Kotyledonen von Leguminosensamen - Werkzeuge ohne Funktion? 12 C. Isolierung und Charakterisierung von Proteinkörpern 20 C.l. Isolierung von Proteinkörpern 20 C.l.l. Proteinkörperisolierung nach Saio und Watanabe (1966) 20 C.l.2. Proteinkörperisolierung nach Tombs (1967) 21 C.l.3. Proteinkörperisolierung nach Finley (1976) 22 C.l.4. Proteinkörperisolierung nach Yatsu und Jacks (1968) sowie nach Prattley und Stanley (1983) 23 C.l.5. Proteinkörperisolierung mit Polyethylenglycol 24 C.1.6. Proteinkörperisolierung mit Cäsiumchlorid-Lösungen 24

3 - 2 - C.l.7. Proteinkörperisolierung nach Einhoff et al. (1986) 25 C.l.8. Proteinkörperisolierung nach Gers-Barlag (1989) 26 C.l.9. Beurteilung der Methoden 27 C.l.10. Isolierung der Proteinkörper aus Glycine max ohne Verwendung organischer Lösungsmittel 30 C.2. Charakterisierung der Proteinkörper 40 C.2.1. Proteine der Proteinkörper 40 C.2.2. Isolierung von Lectin (SBA) aus Proteinkörpern 42 C.2.3. Dichte der Proteinkörper der Sojabohne 46 C.2.4. Größe der Proteinkörper aus Glycine max 48 C.2.5. Glycosidasen in den Proteinkörpern 51 C.2.6. Der ph-wert in den Proteinkörpern 57 C.2.7. Lichtmikroskopische Untersuchungen 58 D. Isolierung und Charakterisierung von Proteinkörpermembranen 61 D.I. Isolierung von Proteinkörpermembranen 61 D.l.l. Isolierung an polyethyleniminummantelten Polyacrylamid Kügelchen 63 D.I.2. Isolierung im Dichtegradienten 63 D.2. Charakterisierung von Proteinkörpermembranen 66

4 - 3 - D.2.1. Lichtmikroskopische Untersuchungen 66 D.2.2. Dichtebestimmung 67 D Proteinbestimmungen 68 D Quantitative Proteinbestimmung 68 D Qualitative Proteinbestimmung 69 D Isolierung der PKM Proteine 70 D Lectin 72 D Glycosidasen 72 D.2.4. Bestimmung organischen Phosphats 72 D.2.5. Untersuchung der Lipide 73 D.2.6. Bestimmung der Fettsäuren (Metcalf und Wang, 1981) 74 E. Wechselwirkungen zwischen Lectin und Proteinkörpermembran 76 E.l. Affinitätschromatographie mit einer PKK- Säule 76 E.2. Wechselwirkungsversuche mittels ELLA 80 E.2.1. Grundlagen 80 E.2.2. Der Einfluß des ph-wertes auf die Wechselwirkung zwischen SBA und Proteinkörpermembran 84 E.2.3. Der Einfluß der Ionenstärke auf die Wechselwirkung zwischen SBA und Proteinkörpermembran 85 E.2.4. Der Einfluß von Monosacchariden in unterschiedlicher Konzentration auf die Wechselwirkung zwischen SBA und Proteinkörpermembran 87 E.3. Wechselwirkungsversuche mit Glycolipden

5 - 4 - aus der Proteinkörpermembran 89 E.4. Wechselwirkung mit Glycoproteinen aus der PKM 92 F. Die Versuchsergebnisse und die mögliche pflanzenphysiologische Funktion der Samenlectine von Leguminosen. 93 G. Zusammenfassung 100 H. Experimenteller Teil 105 H.l. Material 105 H.l.l. Reagenzien und Pflanzenmaterial 105 H.l.2. Geräte 108 H.2. Methoden 114 H.2.1. Pufferherstellung 114 H.2.2. Dialyse 114 H.2.3. Microdialyse 115 H.2.4. Quantitative Proteinbestimmung 115 H Spectralphotometrische Bestimmung 115 H Proteinbestimmung nach Smith et al. (1985) 116 H.2.5. Immobilisierung von Proteinen an Gelmaterial nach Kohn und Wilchek (1982) 117 H.2.6. Spektralphotometrische Bestimmung der Proteinbeladung von Sepharosegelen nach Schurz und Rüdiger (1982) 118

6 - 5 - H.2.7. Ultrafiltration 118 H Ultrafiltration kleiner Mengen 118 H Ultrafiltration bei größeren Mengen 118 H.2.8. Biotinylierung von Proteinen nach Bieber (1990) 119 H.2.8. Titerbestimmung von Lectinen 120 H Herstellung einer Erythrozyten- Suspension 120 H Titerbestimmung 120 H Titerbestimmung unter Zusatz 120 H.2.9. Desialylierung von Schweinemagenmucin nach Beeley (1985) 122 H Bestimmung der freien Sialinsäure nach Jourdian, Dean & Roseman (1971) 123 H Bestimmung glycosidisch gebundener Sialinsäure 123 H Isolierung der Membran von Kaninchen- Erythrozyten (ghost membrane) 124 H Phosphatbestimmung nach Martin und Doty (1949) 126 H Fettsäurenbestimmung aus der Proteinkörpermembran nach Metcalf und Wang (1981) 127 H Durchführung der ELLA-Versuche 129 H Coating der Platte 129 H Waschen der Platte 129 H Blockieren der offenen Bindungs-

7 - 6 - stellen der Platte 129 H Inkubation mit Lectin, Biotin, Streptavidin und Antikörpern 130 H Methoden der Dünnschichtchromatografie 130 H Bestimmung der Phospholipide und Glycolipide 130 H Bestimmung der apolaren Lipide 131 H Elektrophorese-Methoden und Wester-Blott 132 H SDS-PAGE Nach Laemmli (1970) 132 H Herstellung der Gele 132 H Herstellung des SDS-Elektrophorese- Puffers 135 H Vorbereitung der Proteinlösung 136 H Durchführung der SDS-PAGE und Detektion der Proteinbanden 137 H Bestimmung der realtiven Molmasse 137 H Western-Blott 139 H Elektroblotting von SDS-PAGEn 139 H Proteinfärbung mit Indian Ink (Hancock & Tsang, 1983) 140 H Anfärbungen mit SBA-POD 140 H Isolierung von SBA 141 I. Literaturverzeichnis 142 J. Anhang 151 J.l. Verzeichnis der Abbildungen 151 J.2. Verzeichnis der Tabellen 153

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