Biochemische Labormethoden

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1 Martin Holtzhauer Biochemische Labormethoden Zweite, überarbeitete Auflage Mit 15 Abbildungen Springer

2 Abkürzungen XIII 1 Quantitative Methoden Quantitative Proteinbestimmungen Proteinbestimmung nach LOWRY u. Mitarbeitern Standardmethode Mikromethode Proteinbestimmung nach LOWRY U. Mitarbeitern in Gegenwart störender Begleitsubstanzen Proteinbestimmung nach BRADFORD Proteinbestimmung in Probenlösungen für die SDS-Gelelektrophorese Proteinbestimmung mit Amidoschwarz Mikro-Biuret-Methode Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninsäure) Standardmethode Mikromethode Proteinbestimmung nach KJELDAHL : Protein-Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung (Photometrie) Quantitative Nucleinsäurebestimmungen DNA-, RNA- und Proteintrennungsgang nach SCHMIDT und THANNHAUSER RNA-Bestimmung mit Orcin DNA-Bestimmung mit Diphenylamin DNA-bzw. RNA-Bestimmung in Gewebehomogenaten Quantitative Nucleinsäurebestimmung durch UV-Messung Quantitative Phosphatbestimmung Bestimmung von anorganischem Phosphat Bestimmung von Gesamt-Phosphat Phospholipid-Bestimmung Monosaccharid-Bestimmung Auswertung quantitativer Analysen 23 2 Elektrophorese 2.1 Elektrophoresesysteme SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach LAEMMLI SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach WEBER, PRINGLE und OSBORN Harnstoff-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Trennung nierdermolekularer Proteine 36 27

3 VIII Inhaltsverzeichnis TRICINE-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für Proteine und Oligopeptide im Molmassenbereich von 1000 bis Dalton.... r< SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei ph Anodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem Kathodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophorese-System Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (IEF und SDS-PAGE) Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF) Zweite Dimension: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Nicht-denaturierendeNucleinsäure-Elektrophorese Denaturierende Nucleinsäure-Elektrophorese 51 2.L12 Identifizierung von Phosphoaminosäuren (Papierelektrophorese) Hilfsmittel für die Kontrolle der Elektrophorese Markerfarbstoffe für die Kontrolle der Elektrophorese Anodische Systeme Kathodische Systeme Eichproteine für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese Kovalente Farbmarkierung von Eichproteinen Färbemethoden Proteinfärbung mit organischen Farbstoffen Amidoschwarz 10 B Coomassie Brillant Blue R250 bzw. G Fast Green StainsAll Silberfärbung von Proteinen (Glutaraldehyd-Fixierung) Citrat/Formaldehyd-Entwicklung Alkalische Entwicklung Silberfärbung mit Wolframatokieselsäure Kontraststeigerung nach BERSON Silberfärbung von Proteinen (Formaldehyd-Fixierung) Silberfärbung von Glycoproteinen und Polysacchariden Abschwächen von silbergefärbten Gelen : Färbung von Proteinen auf Blotting-Membranen Färbungen auf Nitrocellulose-Blotting-Membranen mit Farbstoffen Proteinfärbung auf Nitrocellulose-Blotting-Membranen mit Tusche Färbung auf Nitrocellulose mit kolloidalem Gold Proteinfärbung auf PVDF-Blotting-Membranen mit Farbstoffen Färbung von Proteolipiden bzw. Lipiden und Lipoproteinen Färbung von Glycoproteinen und Polysacchariden Färbung mit ScHiFFSchem Reagenz (PAS staining) Färbung mit Thymol Elektroelution aus Gelen Quantitative Elektroelution von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen Entfernung von SDS Elektrotransfer von Proteinen (Western blot) 73

4 IX Immunchemischer Antigennachweis nach Elektrotransfer Detektion von Meerrettich-Peroxidase (POD) Detektion von alkalischer Phosphatase (AP) Chemoluminiszenz-Detektion auf Blotti'ng-Membranen Kohlenhydrat-spezifische Glycoprotein-Detektion nach Elektrotransfer Allgemeiner Kohlenhydrat-Nachweis auf Western blots Transfer von Nucleinsäuren (SOUTHERN-bzw. Northern-Blot) Trocknung von Elektrophoresegelen Autoradiographie von radioaktiv markierten Verbindungen in Elektrophoresegelen 83 3 Chromatographische Methoden Dünnschichtchromatographie Bestimmung der N-terminalen Aminosäure im Polypeptid (Dünnschichtchromatographie von modifizierten Aminosäuren) Trennung von Nucleosidphosphaten Gradienten-Dünnschichtchromatographie Nachweis von Phosphaten Lipidextraktion und Dünnschichtchromatographie von Lipiden Säulenchromatographie Praktische Hinweise zur Säulenchromatographie von Proteinen Konzentrierung von Proteinlösungen Säurefällung Aussalzen, Ausfällen mit organischen Verbindungen Lyophilisation Ultrafiltration ' Gelfiltration Auswahl des Trägermaterials Füllen einer Gelfiltrationssäule Probenauftrag und Elution Reinigung Bestimmung von Ausschlußvolumen V o und Gesamtvolumen V, Ionenaustauschchromatographie Vorbehandlung von Ionenaustauscher-Materialien Test der Bindungsbedingungen Probenauftrag Elution Reinigung und Regenerierung Hydrophobe Chromatographie Test der Bindungsbedingungen Elution Regenerierung Affinitätschromatographie Bromcyan-Aktivierung von Polysaccharid-Chromatographieträgern Kopplung an Bromcyan-aktivierte Gele Bestimmung des gebundenen Diamin-Spacers -, > Herstellung Chlorameisensäureester-aktivierter Perlcellulosen Aktivierung mit C1COONB : 126

5 Bestimmung des Aktivierungsgrades von CICOONB-aktivierter Perlcellulose durch HONB-Messung Kopplung von Liganden an CICOONB-aktivierte Perlcellulose Kopplung von Weizenkeim-Lektin an CICOONB-aktivierte Perlcellulose Kopplung von Reaktivfarbstoffen an Polysaccharide (Farbstoff-Affinitätschromatographie) Kovalente Bindung von Biotin (Biotin-Avidin/Streptavidin-System) Hochauflösende Ionenaustausch-Chromatographie (HPIEC) von Mono- und Oligosacchariden Immunchemische Methoden : Konjugation von Haptenen (Peptiden) an Carrier-Proteine Aktivierung von Carrier-Proteinen Konjugation Immunisierung Ammonsulfat-Fraktionierung von Immunoglobulinen HEIDELBERGER-Kurve Doppelt-radiale Immunodiffusion nach OUCHTERLONY Reinigung des Agars Vorbereitung der Platten Immundiffusion Sichtbarmachung der Präzipitationslinien Immunopräzipitation von Antigenen Immunelektrophorese Gegenstromelektrophorese dot-blot-test Enzym-Immunosorbent-Test (EIA bzw. ELISA) Meerrettichperoxidase-Immunoglobulin-Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) Affinitätschromatographische Reinigung von Meerrettichperoxidase Affinitätschromatographie von Immunoglobulin Glutaraldehyd-Konjugation Alkalische Phosphatase-Immunoglobulin-Konjugat (Glutaraldehyd-Methode) Konjugation Indikatorreaktion für AP Kopplung (Konjugation) von Glycoproteinen Protein-kolloidales-Gold-Komplex Herstellung des Goldsols Proteinbeladung Zentrifugation Differentialzentrifugation Dichtegradientenzentrifugation Stufengradientenzentrifugation Saccharosegradientenzentrifugation Präparation von Oberflächenmembranen (Sarkolemm, SL) des Herzmuskels Enzym-Bestimmung: Oubain-sensitive Na,K-ATPase 167

6 XI Rezeptor-Bestimmung: DHP-Bindungsstellen in der Oberflächenmembran Bestimmung der Dissoziations- und Assoziationskinetik des DHP-Rezeptors ' Nicht-denaturierender Saccharosegradient zur RNA-Trennung Denaturierende RNA-Gradientenzentrifugation Isopyknische Zentrifugation Reinigung hochmolekularer DNA im CsCl-Gradienten Zellfraktionierung mittels Percöll Leukozytenpräparation v Drehzahl-Zentrifugalbeschleunigungs-Nomogramme Radioaktive Markierung [ 32 P]-Phosphat-Inkorporation in Proteine Iodierungmit [*"I]-Iodverbindungen Chloramin-T-Methode, Iodierung mit BoLTON-HuNTER-Reagens Radioaktiver Zerfall Zerfallstabellen für [ 32 P]Phosphor, [ 35 S]Schwefel und [ 125 I]Iod Szintillator-Lösungen für die Flüssigszintillationsmessung Puffersysteme pk-werte und Molmassen von Puffersubstanzen Diagramm zur Pufferberechnung ph-farbindikatoren Pufferlösungen Häufig verwendet Pufferlösungen Puffer bzw. Medien für Gewebe- und Zellkulturen bzw. Organperfusion ph-eichpuffer : Flüchtige Puffer Reinigungsvorschriften für ausgewählte Laborchemikalien Reinigungsmittel Reinigungsvorschriften für einige Laborchemikalien Tabellen Konzentrationsmaße Umrechnung Sl-fremder Maßeinheiten in SI-Einheiten Molmassen und andere Stoffdaten häufig verwendeter Substanzen Proteindaten Protease-Inhibitoren Aminosäure-Einbuchstabencode und Molmassen der Aminosäuren Spektroskopische Daten von Nudeotiden Stoffwerte von Detergenzien (Tensiden) Brechungsindex und Dichte von Saccharose-Lösungen Ammoniumsulfat-Tabelle Angaben zur Herstellung verdünnter Lösungen Mischungskreuz : 230

7 XII Inhaltsverzeichnis 10 Anhang Statistische Formeln Mittelwert und zusammenhängende Größen Ausgleichsgerade (lineare Regression) t-test Formeln zur Versuchsauswertung Rezeptorbindungsstudien Enzymkinetik Molmassenbestimmung in SDS-Elektropherogrammen Software für die Laborpraxis Datenauswertung und-präsentation Statistik-Programme Sonstiges 245 Index 246