Bioanalytik DNA-Sequenzierung. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

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1 Bioanalytik DNA-Sequenzierung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

2 Übersicht Thema: next generation sequencing (NGS) Sequenzierung nach Sanger Automatisierung der Sequenzierung Sequenzierung im Hochdurchsatz Beispiel 454-Technologie Beispiel Illumina Technologie Beispiel SoliD System Kosten der Sequenzierung früher und heute Effizienz der Sequenzierung früher und heute Thema: Vorbereitung auf das Praktikum Proteinbestimmungs-Methoden SDS-Page Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 2

3 Sequenzierungsmethode nach Sanger Synthese über das Kettenabbruchverfahren Normalerweise Synthese des komplementären Strangs in 5-3 -Richtung Durch Einsatz von Didesoxynucoleotiden (ddntps) ist die Verlängerung des Stranges nicht mehr möglich. Das molaren Verhältnis von dntp:ddntp wird so eingestellt, dass statistisch an jeder Position ein Kettenabbruch erfolgt Im Gel aufgetrennt erscheint das Reaktionsprodukt als Sequenzleiter Reaktionsprodukt HO Matrizen-DNA Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 3

4 Anfänge der Sequenzierung... Plasmid Einzelstrang Primer, dntps DNA Polymerase (Klenow, T7) Inkubation Denaturierung Elektrophorese Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 4

5 Automatisierung der Sequenzierung Elektropherogramm Leselänge bis zu 1000 bp pro Sequenzierung Ladekapazität: bis zu 96 Proben parallel Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 5

6 Automatisierung der Sequenzierung mit Kapillarelektrophorese Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 6

7 Next generation sequencing Detektion in situ an eine Festphase anstelle einer Gelektrophorese Millionen von Sequenzierungen werden parallel durchgeführt (massively parallel sequencing. Fragmentierung der DNA um die richtige Fragmentlänge für die Sequenzierung zu erhalten. Elektropherogramm Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 7

8 Beispiel 1: 454-Technologie (Roche) Pyrosequencing Nachteile: hohe Kosten für Reagenzien hohe Fehlerrate bei Abfolge von mehr 6 gleichen Nucleotiden Vorteil: Schnelligkeit Gb mit einer Leselänge von bp in ca. 24 h Kosten/Million Basen: $10 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 8

9 Beispiel 1: 454-Technologie (Roche) Pyrosequencing Bildquelle:

10 Beispiel 2: HiSeq-Technologie (Illumina) Sequencing by synthesis Vorteil der Methode: Hoher output: 600 Gb in 8 Tagen Vom Preis die günstigste Methode Nachteil: Im Fortgang der Sequenzierung kommt es zu höheren Fehlerraten, da Fluoreszenz- Markierungen teilweise unvollständig entfernt werden. Kosten/Million Basen: 0,07 $ Youtube:Illumina Solexa Sequencing Draven Illumina Sequencing Technology Illumina Inc 10

11 Durchflusszelle der Illumina Technologie

12 Bridge amplifikation

13 Beispiel 3: SoliD System Sequencing by Ligation and two-base coding Bildquellen: DNA wird durch Ultraschall auf Fragmente mit bp zerkleinert Reparatur der Enden und Phosphorylierung Ligation von zwei Adaptern P1 (zur Bindung an capture beads) und P2 (zur Sequenzierung) Bindung an Capture Beads und klonale Amplifikation durch Emulsions-PCR Die 3`-Enden werden durch terminale Transferase modifiziert und mit einem Linker versehen, der Bindung an Sequenzierchip ermöglicht 13

14 Beispiel 3: SoliD System Sequencing by Ligation and two base coding Bindung der Capture beads an Sequenzierchip Bildquellen: Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 14

15 Beispiel 3: SoliD System Sequencing by Ligation and two base coding Sequenzierbrimer binden an Matrizen DNA Pool aus Fluoreszenz-markierten 2-Basen spezifischen Oligonukleotiden konkurrieren um Bindung hinter dem Sequenzierprimer. Oliginukleotid und Sequenzierprimer werden miteinander ligiert. Es folgt die Detektion der Fluoreszenz. Die letzten Basen sind universal und werden nach jedem Zyklus durch einen Schnitt entfernt. Es folgen mehrere Zyklen aus Ligation, Detektion und Abspaltung Am Ende wird das verlängerte Produkt vollständig entfernt und das Templat wird mit Hilfe eines Primers, der an N-1 Position bindet erneut seuquenziert. Bildquellen: Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 15

16 Beispiel 3: SoliD System Sequencing by Ligation and two base coding Vorteil der Methode: Hohe Genauigkeit Jede Base wird 2-mal in einem Hybridisierungsereignis erkannt. Nachteil: Es werden jeweils nur sehr kurze Fragmente sequenziert Output: Leselänge 75 bp, 150 Gb in 7 Tagen Bildquellen: Applied Biosystems, white paper: A Theoretical Understanding of 2 Base Color Codes and Its Application to Annotation, Error Detection, and Error Correction, Methods for Annotating 2 Base Color Encoded Reads in the SOLiD System, Heinz Breu Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 16

17 Entwicklung der Sequenzierung innerhalb der letzten Jahrzente Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 17

18 Kostenreduktion in der Sequenzierung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 18

19 Literatur: Lin Liu et al., Comparison of Next-Generation Sequencing Systems Journal of Biomedicine and Biotechnology Article ID Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 19

20 Next generation sequencing. Verschiedene Geräte mit unterschiedlicher Leistung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 20

21 Bioanalytik Vorbereitung auf das Praktikum, Proteinbestimmung und SDS-Page Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

22 Proteinbestimmung: Aufbau von Proteinen Proteine sind aus 20 verschiedenen proteinogenen Aminosäuren zusammengesetzt Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 22

23 Proteinbestimmung: Aufbau von Proteinen Bildquelle: Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 23

24 Methoden zur Proteinbestimmung Assay Prinzip Grenze Störungen Comment Biuret Lowry BCA Bradford 280nm 205nm Cu(II) Komplex an Peptidbindung Biuret + Cu(II)-Reduktion Farbstoff Biuret + Cu(II)-Reduktion BCA-Komplexierung Anlagerung an basische / große, hydrophobe Reste Absorption aromatischer Reste Absorption der Peptidbindung 1-10 µg/ml 0,1-1 µg/ml NH 4+, Glucose, TRIS, Natriumphosphat EDTA, SDS, NH 4+, Mercapto- Verbindungen 0,1-1 µg/ml NH 4+, EDTA 0,05-0,5 µg/ml Detergenzien 20 µg/ml DNA, RNA 1 µg/ml Sehr viele Puffer & Lösemittel Schnell, aber insensitiv langwierig, abhängig von aa- Zusammensetzung Geeignet für Lsg. mit Detergenzien Schnell, aber abhängig von AS- Zusammensetzung Kompensierbar durch Bestimmung von (260/280nm) Verlangt exakte Messung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 24

25 Spektroskopische Methoden zur Proteinbestimmung Photometrische Bestimmung bei definierter Wellenlänge in einem Strahlengang mit Quarzküvette mit 1 cm Schichtdicke. Gemessen wird gegen proteinfreie Referenzlösung. Der Absorptionswert sollte 1,0 nicht überschreiten, da über 1,0 die Linearität der Abhängigkeit von spektraler Absorption zur Konzentration nicht mehr gegeben ist. In der Praxis wird oft eine Extinktion von 1,0 bei 280 nm mit einer Proteinkonzentration von 1 mg/ml gleichgesetzt. Da es hier of Abweichungen gibt, dient diese Abschätzung nur zur ungefähren Proteinbestimmung Methode Proteinbestandteil, auf dem der Nachweis maßgeblich basiert Nachweisgrenzen (in µg Protein/ml) Abhängigkeit von Proteinzusammensetzung photometrisch: Tryptophan, Tyrosin stark gering A 280 A 205 Peptidbindungen wenig hoch Störanfälligkeit Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 25

26 Quantitative Bestimmung durch Färbetests: Bradfort-Assay Bindung des Proteins an den Farbstoff Coomassie-Brillantblau in Phosphorsäure. Unspezifische Bindung primär an Arginin (geringer an Histidin, Lysin, Tyrosin, Tryptophan und Phenylalanin Duch Bindung ans Protein verschiebt sich das Absorptionsmaximum von 465 zu 595 nm. Wird auch für die Anfärbung in Elektrophoresegelen verwendet Coomassie-Brillantblau G250 als Sufonat Arginin Histidin Lysin Nachteil: Die Reaktion läuft im sauren Milieu ab, in dem viele Proteine ausfallen. Starke Laugen und Seifen wie Triton X-100, SDS oder Chaps stören. Gleiche Mengen an verschiedenen Standardproteinen zeigen erhebliche Differenzen in resultierenden Absorptionskoeffizienten Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 26

27 Quantitative Bestimmung durch Färbetests: Biuret-Assay Cu2 + bildet mit mindestens 2 Peptidbindungen der Proteine einen Farbkomplex. Diese Reaktion ist mit der Reaktion von Cu 2+ mit gelöstem Biuret (Carbamoylfarbstoff) vergleichbar Es entsteht ein rotvioletter Farbkomplex, der bei 540 oder 550 nm gemessen werden kann. Tyrosinreste binden C2+ ebenfalls und bilden Farbkomplex Nachteil: Unempfindlicher Test (Nachweisgrenze: 1-10 µg) Störend wirken: Ammonium, Glucose, Sulfhydrylgruppen, Natriumphosphat Tyrosin Biuret (Carbonsäureamid) Farbiger Protein-Cu 2+ -Komplex Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 27

28 Quantitative Bestimmung durch Färbetests: Lowry-Assay modifiziert nach Hartree Kombination von Biuret-Reaktion mit Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagens In alkalischer Lösung bildet sich Cu-Proteinkomplex, darin wird in der Reaktion Cu 2+ durch Tyrosin, Tryptophan, Cystein und Cystin zu Cu + reduziert das mit Folin-Ciocalteu-Phenol-Reagens reagiert. Zusätzliche Farbreaktion erhöht die Sensitivität im Vergleich zur Biuret Komplexierung Messung der tiefblauen Färbung bei 750 nm, 650 nm oder 540 nm Nachteil: Störend wirken: Ammoniumsulfat, EDTA, Triton X-100, Färbung instabil, daher zügige Messung erforderlich. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 28

29 Quantitative Bestimmung durch Färbetests: Bicinchoninsäure-Assay (BCA-Assay) Verwendung von Kupfersulfat/Bicinchoninsäure (BCA)-Lösung Methode beruht auf der Reduktion von Cu 2+ zu Cu +. Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Cystin und Peptidbindungen können Cu reduzieren und daher Farbreaktion ermöglichen BCA bildet mit CU + einen Farbkomplex der bei 562 nm gemessen werden kann. Das Redoxverhalten der beteiligten Gruppen hängt von der Temperatur ab. Somit kann die Sensitivität über die Inkubationstemperatur variiert werden. Nachteil: Störend wirken: Ammoniumsulfat, 1,0 M Glycin, >5% Ammoniumsulfat, 2M Natriumacetat, 1 M Natriumphosphat, Vorteil gegenüber Lowry: einfache Durchführung, Stabilität des Farbkomplexes Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 29

30 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli Die meisten Proteine binden die Seife SDS (engl. sodium dodecyl sulfate, SDS), SDS überdeckt die Eigenladung von Proteinen. Es entstehen Micellen mit konstanter negativer Ladung pro Masseneinheit. (1,4 g SDS/ g Proteine in 1% SDS-Lösung) Durch Erhitzen auf 95 C in Gegenwart von SDS und β-mercaptoethanol oder Dithiothreitol werden bei der Probenvorbereitung die Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine aufgelöst und die Proteine linearisiert. Die Auftrennung im elektrischen Feld erfolgt im SDS-haltigen Polyacrylamidgel mit diskontinuierliches Tris-HCl/TrisGlycin-Puffersystem in dem es eine lineare Beziehung zwischen Logarithmus der Molmasse und der Wanderungsstrecke gibt. Mithilfe von Standards lassen sich die Molmassen der Proteine ermitteln. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 30

31 Auftrennung im SDS-Gel Der Experimentator: Immunologie, 4. Auflage, pp Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 31

32 Diskontinuierliche Gelelektrophorese Schärfere Banden durch, da Aggregation von Proteinen verindert wird. Gelmatrix wird in zwei Bereiche eingeteilt. Das Sammelgel und das Trenngel. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 32