Bioanalytik-Vorlesung. Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

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1 Bioanalytik-Vorlesung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

2 Vorlesung Bioanalytik Themen Vorlesung Datum Thema Grammann Eiden Nukleinsäureanalytik (Quantifizierung, Blotting, Hybridisierung, FISH) X Microarray X DNA-Sequenzierung, Next Generation Sequencing X Real-time PCR, Quantifizierung X Zell-Aufschlussmethoden, Ammonium-Fällung, Protein-Reinigung, X Chromatographische Methoden X Elektrophorese X Western-Blots, Enzym-Aktivitätsassays X ELISA X Immunoassays X Proteinaufreinigung mit Tags X Bindungsanalytik X Kalorimetrie, Fluoreszenz, X-ray X Wiederholung X Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 2

3 Lehrveranstaltung Bioanalytik Vorlesung: Montags, 10: Uhr Übungen: Montags, 12:00-12:45 Uhr und 12:45-13:30 Uhr; Start: Praktikum: Proteinreinigung: Donnerstags ab ; ab 8:00 Uhr ganztägig; Gruppeneinteilung siehe Aushang! IR-Spektroskopie: Donnerstags ab Gruppe 1 und 4 Gruppe 1a) Beginn 9:00 Uhr Gruppe 1b) Beginn 10:30 Uhr Gruppe 4a) Beginn 12:30 Uhr Gruppe 4b) Beginn 14:00 Uhr Gruppe 2 und Gruppe 3 und 6 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 3

4 Einführung in die Bioanalytik Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

5 Was ist Bioanalytik Proteine Analytik von Makromolekülen Lipide RNA DNA Kohlenhydrate Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 5

6 Bioanalytik: Worum geht es? Methoden kennenlernen und verstehen was dahinter steckt, z.b. Messprinzip, Technik Potenziale und Limitationen kennen lernen, um bewerten zu können inwieweit die Theorie oder Ausage gültig ist. Darüber hinaus geht es um Methoden zur präparativen Aufarbeitung von DNA, RNA und Proteinen, da sie unmittelbar mit den Analysetechniken zusammen hängen. Sie machen häufig den größten Teil der Arbeit ausmachen Ziel Welche Methode verwende ich für die Lösung meines Problems/meiner Fragestellung? Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 6

7 Literaturempfehlung Siehe außerdem Literaturempfehlungen auf den Folien! Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 7

8 Wichtige Meilensteine der Biowissenschaften Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 8

9 Nucleinsäure-Analytik Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16

10 Inhalt der Vorlesung DNA-Gelelektrophorese Quantifizierung von DNA RNA-Gelelektrophorese Blotting-Verfahren Hybridisierung Sondensynthese Fluoreszenz-in-situ Hybridisierung (FISH) Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 10

11 Das Agarosegel Agarose ist das wichtigste Trägermaterial für die Elektrophorese von Nucleinsäuren Was ist Agarose: Starker Gelbildner Ist die Hauptkomponente des Agars und wird aus Rotalgen gewonnen Agarose ist ein Polysaccharid aus D-Galactose und 3,6-Anhydrogalactose, die über eine Glykosidbindung miteinander verknüpft sind Gele sind relativ großporig: 150 nm Porengröße bei 1 % (g/ml -1 ) Vorteil: 500 nm Porengröße bei 0,16 % ungiftig, leicht herzustellen, für die Trennung von DNA, RNA und großen Proteinen (>500 kda) Nachteil: haben niedrige Siebwirkung für Proteine unter 100 kda, sind nicht ganz klar. Nicht für Silberfärbung geeignet Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 11 Quelle: Wikipedia

12 DNA-Gelelektrophorese Die Gelelektrophorese wird zur Größenbestimmung linearer DNA- Fragmente genutzt. Bei der Elektrophorese wandern geladene Teilchen in einem elektrischen Feld. Für die Auftrennung von DNA wird ein Gel als poröse Matrix eingesetzt, das die Wanderung der DNA-Moleküle je nach Göße verzögert. DNA ist aufgrund der Phosphatgruppen im Zucker-Phosphat- Rückgrat negativ geladen und wandert im elektrischen Feld zum positiven Pol. Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 12

13 DNA-Gelelektrophorese: Verwendung von Größenmarkern Agarose-konzentration (%) Größe der linaren Nucleinsäure (bp) 0,3 1, , , , , , , Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 13

14 Nachweis der DNA im Gel: Ethidiumbromid Ethidiumbromid ist ein organischer Farbstoff, der in die DNA/RNA interkaliert. Der Farbstoff macht DNA/RNA bei Anregung durch UV-Licht ( nm) sichtbar. Der Farbstoff emittier Licht im orange-roten Bereich 590 nm) Das Gel wird r.d.r. nachträglich gefärbt Nachweisgrenze ca. 20 ng doppelsträngige DNA Nachteil: Ethidiumbromid ist ein starkes Mutagen! Quelle: Wikipedia Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 14

15 Nachweis der DNA im Gel: SYBR Green Der Farbstoff wird vor dem Auftragen auf das Gel direkt in die DNA-Probe pipettiert. Die Intensität der Fluoreszenz wird durch Bindung an DNA um das 100 fache verstärkt. Wird bei einer Wellenlänge von 492 nm optimal angeregt. Emittiert bei 519 nm. Nachweisgrenze: ~ 100 pg doppelsträngige DNA Quelle: clarechemical.com SYBR Green Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 15

16 DNA-Quantifizierung einzelner DNA-Fagmente im Gel Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 16

17 DNA/RNA-Quantifizierung mit dem UV/Vis Spektralphotometer Messungen im Nanodrop Messung in einer Küvette mit 1 cm Schichtdicke: 1 OD 260 entspricht 50 µg ml -1 doppelsträngiger DNA 40 µg ml -1 einzelsträngiger DNA 33 µg ml -1 einzelsträngiger RNA Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 17

18 RNA-Gelelektrophorese 4718bp 1874p Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 18

19 Blottingverfahren Unterscheidung der Transfertechnik Kapillarblot: Übertragung durch Kapillarkräfte Elektroblot: Wanderung der DNA/RNA im elektrischen Feld Vakuumblot: Übertragung durch Vakuum Unterscheidung was tranferiert wird Southern-Blotting: DNA Northern-Blotting: RNA Western-Blotting: Protein Bildquelle: Lottspeich/Engels, Bioanalytik, 3. Auflage, Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2012 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 19

20 Southern Blotting und Hybridisierung Durchführung von Blots mit genomischer DNA: DNA wird durch verschiedene Restriktionsenzyme geschnitten. Durch Hybridisierung mit einer spezifischen Sonde kann. Anwendung: um die Präsenz eines Gens und dessen Spaltungsmuster zu untersuchen. um die Konservierung und Verbreitung des Gens in unterschiedlichen Spezies zu untersuchen (Zoo-Blot). um single- copy Gene zu untersuchen/identifizieren. um Insertionsorte von Transposons zu identifizieren. Bildquelle: Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 20

21 Northern Blotting Übertragung auf Membranen wie beim Southern Blot Anwendung: Untersuchung der Expression auf Ebene der Transkription Problem: mrna-transkripte werden of von ribosomaler RNA überlagert und sind nicht sichtbar! Bildquelle: Doktorarbeit Katrin Grammann, Universität Bonn, 2004 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 21

22 Slot-und Dot-Blot-Apparatur Anwendung: Quantitative Bestimmung einer Nucleinsäure innerhalb eine Nucleinsäuregemisches Austesten einer Vielzahl von Proben auf Präsenz einer bestimmten Nucleinsäuresequenz. Vorteil: es können viele Proben gleichzeitig getestet werden. Keine Differenzierung nach Länge der Nucleinsäure, da vorher keine Fraktionierung durch Gelelektrophorese! Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 22

23 Praxisbeispiel: Expressionsstudien mithilfe des Slot- Blottings Abb. 16: teaa-genexpressionsanalysen bei 1 und 4% NaCl (w/v) in angepaßten und geschockten Zellen von H. elongata WT Für den Nachweis des teaa-transkripts wurde H. elongata Wildtyp in Minimalmedium einem Salzschock durch Erhöhung der Mediensalinität von 1 % auf 4 % ausgesetzt. Während des Salzschocks wurden für die RNA-Isolierungen in regelmäßigen Abständen Proben genommen. In die Hybridisierung wurde eine teaa-sonde eingesetzt, die das Einzeltrankskript des Substratbindeproteins nachweist. Angaben in µg beziehen sich auf die eingesetzten RNA-Mengen. Die Qualität der RNA-Proben wurde gleichzeitig in einem Agarosegel (1 %) überprüft. Bildquelle: Doktorarbeit Katrin Grammann, Universität Bonn, 2004 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 23

24 Hybridisierung Die Stabilität des Hybrids wird bestimmt durch: Ionenstärke Konzentration helixdestabilisierender Moleküle (Formamid) Temperatur Je höher die Stringenz desto spezifischer erfolgt die Basenpaarung zwischen komplementären Basen. target DNA Tm = 81,5 C + 16,61(log M) + 0,41(%CG) - 820/n - 0,6(%FA) M %CG n %FA : Molarität der Hybridisierungslösung : Anteil der Basen C und G : Anzahl der Basenpaare : Prozent Formamid in der Hybridisierungslösung Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 24

25 Hybridisierungs-Sonden Als Sonden werden Oligonucleotide, DNA-Fragmente, PCR-Produkte, in vitro RNA Transkripte oder artifizielle Sonden eingesetzt direkte Markierung: Fluorochrom (Reporter) ist kovalent an die Sonde gebunden. indirekte Markierung: Hapten-gekoppelte Sonden, das Hapten (unvollständiges Antigen) wird nach der Hybridisierung in einer zweiten Markierungsreaktion nachgewiesen häufig Biotin/Streptavidin oder Digoxigenin/Antidigoxigenin DNA-Markierungsverfahren: PCR random priming Nick-translation Reverse Transkription RNA-Markierungsverfahren: run-off-in-vitro-transkription mit RNA-Polymerasen in-vitro-transkription am PCR-Fragment Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 25

26 Detektion mit Digoxigenin/Chemilumineszenz Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 26

27 Detektion mit Biotin Bildquelle: Molekulare Biotechnologie S 65 Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 27

28 Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) Wofür: Pränataldiagostik, Nachweis von Erbkrankheiten Nachweis von Chromosomenaberrationen (Chromosomenanomalien) FISH-Experimente werden am Fluorezenz- Mikroskop ausgewertet! Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 28

29 Fluoreszenz allgemein Vorlesung Bioanalytik/ Westfälische Hochschule WS 1015/16 29