Mathematik im Labor. Ein Arbeitsbuch für Molekularbiologie und Biotechnologie. Frank H. Stephenson. Spektrum k /TAKADEMISCHER VERLAG

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1 Frank H. Stephenson Applied Biosystems Mathematik im Labor Ein Arbeitsbuch für Molekularbiologie und Biotechnologie Aus dem Englischen übersetzt von Kerstin Mahlke ELSEVIER SPEKTRUM AKADEMISCHER VERLAG Spektrum k /TAKADEMISCHER VERLAG

2 Inhaltsverzeichnis Vorwort XI 1 Wissenschaftliche Notation und metrische Vorsilben 1 Einleitung 1 Signifikante Stellen 1 Runden signifikanter Stellen bei Berechnungen 2 Exponenten und wissenschaftliche Notation 3 Ausdrücken von Zahlen in wissenschaftlicher Notation 4 Umwandlung von Zahlen aus der wissenschaftlichen Notation in Dezimalnotation 6 Addieren und Subtrahieren in wissenschaftlicher Notation geschriebener Zahlen.. 7 Multiplizieren und Dividieren in wissenschaftlicher Notation geschriebener Zahlen 8 Metrische Vorsilben 12 Umrechnungsfaktoren und Kürzen von Ausdrücken 12 2 Lösungen, Gemische und Medien 16 Einleitung 16 Berechnung von Verdünnungen: Ein allgemeiner Ansatz 16 Konzentration um einen Faktor X 18 Herstellung in Prozent angegebener Lösungen 20 Verdünnen in Prozent angegebener Lösungen 21 Mol und Molekülmasse: Definitionen 25 Molarität 26 Verdünnen molarer Lösungen 28 Umwandlung von Molarität in Prozent 29 Umwandlung von Prozent in Molarität 30 Normalität 31 ph 32 3 Zellwachstum 38 Die bakterielle Wachstumskurve 38 Arbeiten mit der Zellkonzentration 42 Auftragen der OD550 gegen die Zeit im linearen Koordinatensystem 44 Auftragen des Logarithmus der OD550 gegen die Zeit im linearen Koordinatensystem 45 Berechnung der Generationszeit 47 Auftragen von Zeilwachstumsdaten im halblogarithmischen Koordinatensystem.. 50 Direkte Bestimmung der Generationszeit durch Auftragen der Zellkonzentration gegen die Zeit im halblogarithmischen Koordinatensystem 54

3 VIII Inhaltsverzeichnis Auftragen der Zelldichte gegen die OD 55 o im halblogarithmischen Koordinatensystem 55 Der Fluktuationstest 56 Beispiel für einen Fluktuationstest 57 Varianz 59 Messen der Mutationsrate 61 Bestimmung der Mutationsrate auf Agarplatten 68 Messen der Zellkonzentration im Hämocytometer 70 4 Arbeiten mit Bakteriophagen 71 Einleitung 71 Multiplizität der Infektion 71 Wahrscheinlichkeiten und Multiplizität der Infektion 73 Messen des Phagentiters 79 Verdünnen von Bakteriophagen 80 Messen des Phagenertrags 82 5 Quantitative Bestimmung von Nucleinsäuren 85 Quantitative Bestimmung von Nucleinsäuren mittels UV-Spektroskopie 85 Bestimmung der Konzentration doppelsträngiger DNA 86 Berechnung der Konzentration doppelsträngiger DNA mittels Absorption und Extinktionskoeffizient 89 Berechnung einer millimolaren (mm) DNA-Konzentration 90 Bestimmung der Konzentration einzelsträngiger DNA-Moleküle 91 Quantifizierung von Oligonucleotiden 94 Messen von RNA-Konzentrationen 98 Molekülmasse, Molarität und Nucleinsäurelänge 98 Abschätzen der DNA-Konzentration auf einem Ethidiumbromidgel 102 O Markierung von Nucleinsäuren mit Radioisotopen 103 Einleitung 103 Einheiten zur Messung der Radioaktivität: das Curie 103 Abschätzung der Plasmidkopienzahl 104 Markierung von DNA mittels Nick-Translation 106 Markierung von DNA mit zufallsgemäß erzeugten Primern (Random Primer Labeling) 108 Markierung von 3'-Enden mit Terminaler Transferase 112 cdna-synthese 114 Homopolymer-Tailing 120 In vz'fro-transkription Oligonucleotidsynthese 127 Einleitung 127 Syntheseausbeute 128

4 Inhaltsverzeichnis IX Messen der Ausbeute pro Schritt und der Gesamtausbeute mittels DMT-Kationen-Test 130 Gesamtausbeute 130 Ausbeute pro Schritt 131 Berechnung der bei jeder Basenaddition hinzugefügten Nucleosidmenge in Mikromol 133 O Die Polymerasekettenreaktion 134 Einleitung 134 Matrize und Amplifikation 134 Exponentielle Amplifikation 136 PCR-Effizienz 138 Berechnen von T m der Zielsequenz 141 Primer 144 T m des Primers 148 dntps 155 DNA-Polymerase 158 Quantitative PCR 161 Verwendete und weiterführende Literatur Rekombinante DNA 174 Einleitung 174 Restriktionsendonucleasen 174 Die Häufigkeit von Restriktionsendonuclease-Schnittstellen 176 Berechnung der Menge an Fragment-Enden 177 Ligation Transformationseffizienz 193 Genomische Banken: Wie viele Klone braucht man? 195 cdna-banken: Wie viele Klone reichen aus? 196 Expressionsbanken 197 Screening rekombinanter Banken durch Hybridisierung mit DNA-Sonden 199 Größenbestimmung von DNA-Fragmenten mittels Gelelektrophorese 209 Erzeugung verschachtelter Deletionen mit Nuclease B AL Literatur 224 1U Proteinbestimmung 225 Einleitung 225 Quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration durch Messen der Absorption bei 280 nm 225 Bestimmung der Proteinkonzentration mit Absorptionskoeffizienten und Extinktionskoeffizienten 226 Zusammenhang zwischen Absorptionskoeffizient und molarem Extinktionskoeffizient 228 Bestimmung des Extinktionskoeffizienten eines Proteins 228

5 X Inhaltsverzeichnis Zusammenhang zwischen der Konzentration in Milligramm pro Milliliter und der Molarität 230 Quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration bei 280 nm beim Vorliegen von Nucleinsäureverunreinigungen 231 Quantitative Bestimmung der-proteinkonzentration bei 205 nm 232 Quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration bei 205 nm beim Vorliegen von Nucleinsäureverunreinigungen 233 Messen der Proteinkonzentration mit einem kolorimetrischen Test - der Bradford-Test 234 Messung von Promotoraktivität und Genexpression mittels ß-Galactosidase 236 Spezifische Aktivität 238 Der CAT-Test 241 Verwendung von Luciferase in einem Reportertest 244 In v/fro-translation - Bestimmung des Aminosäureeinbaus 245 Literatur Zentrifugation 248 Einleitung 248 Relative Zentrifugalkraft (,,g"-kraft) 248 Umwandlung von g in Umdrehungen pro Minute 250 Bestimmung von g"-kraft und Umdrehungen pro Minute mit einem Nomogramm 251 Berechnung der Sedimentationszeiten 253 Index 256