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1 Inhalt Was ist? Eine Definition Optimierung Anwendungsgebiete - in der Gentechnologie - in der Diagnostik Zusammenfassung von Christian Jogler (Abteilung für Mol. & Med. Virologie) Was ist? Eine Definition Was ist? Eine Definition engl. = Polymerase chain reaction Methode zur Herstellung zahlreicher Kopien eines DNA Moleküls... deutsch = Polymerase-Kettenreaktion DNA Moleküle Definition: DNA Molekül Methode zur Herstellung zahlreicher Kopien eines DNA Moleküls durch enzymatische Vervielfältigung einer Ausgewählten Sequenz. Glossar: Gentechnologie für Einsteiger Was ist? Eine Definition Was ist? Eine Definition... durch enzymatische Vervielfältigung einer Ausgewählten Sequenz. Thermus aquaticus Taq-Polymerase 3 CACGAC 5 5 GTGCTG 3 3 CACGAC 5 5 GTGCTG 3

2 Was ist? Eine Definition Methode zur Herstellung zahlreicher Kopien eines DNA Moleküls durch enzymatische Vervielfältigung einer Ausgewählten Sequenz. Die besteht aus drei Phasen: Trennen der Stränge (Denaturierung) 3 CACGAC 5 5 GTGCTG 3 Taq-Polymerase Hybridisierung (Annealing) Kettenverlängerung (Elongation) Zyklus Typisches -Protokoll: 94 C 1 Minute (Denaturierung) Temperaturverlauf während eines Zyklus 52 C 30 Sekunden (Annealing) 30 Zyklen 72 C 1 Minute (Elongation) T.A. Brown; Gentechnologie für Einsteiger; Spektrum Akademischer Verlag Was passiert während der drei Phasen von Denaturierung, Hybridisierung und Elongation? 3 CACGAC 5 5 GTGCTG 3 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3

3 Phase1: Denaturieren (95 C) Phase1: Denaturieren (95 C) 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 Phase1: Denaturieren (95 C) Phase1: Denaturieren (95 C) 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 Phase2: Hybridisieren (~52 C) 3 GTCTAG 5 Phase2: Hybridisieren (~52 C) 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 CAGATC 3 5 CAGATC 3 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 3 GTCTAG 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3

4 Phase2: Hybridisieren (~52 C) Phase2: Hybridisieren (~52 C) 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 CAGATC 3 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 CAGATC 3 TAQ 3 GTCTAG 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 3 GTCTAG 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 TAQ Phase3: Elongation (72 C) Phase1: Denaturieren (95 C) 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 TAQ 5 CAGATC 3 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 5 CTGGTGCTGGTGCTG 3 3 GTCTAG 5 TAQ 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 3 CACGACCACGTCT AGTCGACCACGTCTAG 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3 Phase1: Denaturieren (95 C) Die Vervielfältigung der klassischen ist exponentiell: 3 CACGACCACGAC CACGAC 5 Zyklus1 Zyklus2 Zyklus3 5 CTGGTGCTGGTGCTG 3 3 CACGACCACGTCT AGTCGACCACGTCTAG 5 5 GTGCTGGTGCTGGTGCTG 3

5 Die Vervielfältigung der klassischen ist exponentiell: Zyklus0 Zyklus1 Zyklus2 Zyklus Für 30 Zyklen ergeben sich: Optimierung Ein Ansatz: DNA Template Sense Antisense dntps - Puffer MgCl Wasser 2 28 Fragmente = Optimierung Ein Ansatz: DNA Template (0,1 500 ng) Sense (ca. 20 pmol) Antisense (ca. 20 pmol) dntps ( µm) - Puffer MgCl 2 (1 5 mm) Wasser (ad. 50 ml) Optimierung DNA Template (0,1 500 ng) Optimale Reinheit; möglichst keine RNA Für Humane DNA maximal 500 ng einsetzen Für Bakterielle DNA 1-10 ng einsetzen Für Plasmid DNA 0,1 500 ng einsetzen Generell: Je weniger DNA Template, desto mehr Zyklen und entsprechend mehr Fehler Template DNA möglichst nicht in TE lösen! Am besten Wasser oder 5-10 mm Tris (ph 7-8) Optimierung Länge: Nukleotide GC Anteil zwischen 40 und 60% Bestenfalls keine internen Sekundären Strukturen Möglichst gleiche Schmelztemperatur der Die Annealing Temperatur ca. 5 C unter der Schmelztemperatur wählen (ca C) Menge 20 pmol pro Optimierung Funktion von Mg 2+ Ionen (1 mm 5 mm) Mg2+ Ionen formieren lösliche Komplexe mit DNA und dntps, dem Substrat der Polymerase dntps, PPi, und EDTA binden Mg2+ Ionen Für 200 µm pro dntp durchschnittlich 1,5 mm Mg2+ Zuviel Mg2+ Ionen erhöhen die unspezifische Bindung, sowie den Hintergrund der Zu wenige Mg2+ Ionen senken die Ausbeute an Produkt

6 Anwendungsgebiete der Anwendungsgebiet Gentechnologie - in der Gentechnologie - in der Diagnostik - Klonierung von -Produkten - Mutagenese - Isolierung Einzelsträngiger DNA - RT- - Besondere Templates Klonierung von - Produkten Klonierung von - Produkten Die Taq- Polymerase hängt ans 3 Ende ein zusätzliches Nukleotid an Zur Klonierung kann ein linearer Vektor mit einem zusätzlichen T- Nukleotid am 5 Ende genutzt werden 5 CACGTC...TAGTCGACA 3 3 AGTGCAG...ATCAGCTG 5 Eine blund-enden Ligation scheidet somit aus Klonierung von - Produkten Klonierung von - Produkten Hierzu sind kommerzielle Systeme erhältlich, wie z.b. Der TOPO TA Cloning-Kit (Fa. Invitrogen) Tyr-274 Alternativ kann der Vektor selbst hergestellt werden: Beliebigen Klonierungsvektor mit glatten Enden -Ansatz ohne und ohne dntps, statt dessen mit dttp Taq- Polymerase hängt T-Nucleotid an 3 - Ende an Tyr-274

7 Klonierung von - Produkten Klonierung von - Produkten Weitere Möglichkeit: Schnittstellen in Produkt durch einfügen Einfügen einer Bam HI Schnittstelle Anwendungsgebiet Gentechnologie Mutagenese - Klonierung von -Produkten - Mutagenese - Isolierung Einzelsträngiger DNA - RT- - Besondere Templates - Deletions Mutagenese mit mismatched n - Deletions Mutagenese mittels -Fusion - Deletions Mutagenese mittels inverted - Basenaustausch durch Overlap Extension - Basenaustausch durch asymmetrische - basierende USE (Unique site elimination) Mutagenese - Insertions Mutagenese durch Overlap Extension - sticky-feet Insertions Mutagenese Anwendungsgebiet Gentechnologie - Klonierung von -Produkten Isolierung Einzelsträngiger DNA - Mutagenese - Isolierung Einzelsträngiger DNA - RT- - Besondere Templates

8 Anwendungsgebiet Gentechnologie RT- - Klonierung von -Produkten Das Grundprinzip der RT- - Mutagenese - Isolierung Einzelsträngiger DNA - RT- - Besondere Templates RT- RT- Die RT- besteht aus zwei unabhängigen Reaktionen: Der Reversen Transkription, die mrna in cdna umschreibt Die Reaktionen können in einem Schritt (Tube) durchgeführt werden: One Step RT- Der, die ein cdna Abschnitt vervielfältigt Die Reaktionen können in zwei Schritten (Tubes) mit Pufferwechsel durchgeführt werden: Two Step RT- RT- RT- Prinzip der Transskription Intron Transskription DNA Design zur Eliminierung genomischer DNA Kontaminationen genomischedna mrna Intron RT- RT- mrna Kein Produkt Produkt

9 RT- RT- Design zur Detektion genomischer DNA Kontaminationen Auswertung mittels Gelelektrophorese Genom DNA Intron mrna Marker Fall 1 Fall 2 Fall 1: DNA Kontamination Fall 2: keine DNA Kontamination RT- RT- großes Produkt Kleines Produkt Anwendungsgebiet Gentechnologie Besondere Templates - Klonierung von -Produkten - Mutagenese - Isolierung Einzelsträngiger DNA - RT- - Besondere Templates In einigen Fällen sind besondere Modifikationen der notwendig: - Wenn sehr lange Fragmente amplifiziert werden sollen - Wenn die Template DNA sehr AT bzw. GC reich ist Für derartige anwendungen sind spezielle Kits kommerziell erhältlich, die sich durch Ihre Polymerase sowie Pufferbedingungen unterscheiden Besondere Templates Wichtige Alternative zur Taq- Polymerase: Pfu- DNA Polymerase (= proofreading Polymerase) Im Gegensatz zur Taq Polymerase (termus aquaticus) aus dem hyperthermophilen Archaebacterium Pyrococcus furiosus isoliert Die Pfu- Plymerase hat eine 3 5 exonuclease (proofreading) Aktivität. Besondere Templates Pfu- DNA Polymerase (= proofreading Polymerase) Pyrococcus furiosus (Desulfurococcales) Hyperthermophiles Bakterium aus submarinen vulkanischen Biotopen Temperaturoptimum: 100 C Enzyme derartiger Organismen sind optimal an hohe Temperaturen angepaßt

10 Besondere Templates Anwendungsgebiet Diagnostik Pfu- DNA Polymerase (= proofreading Polymerase) 3 5 exonuclease (proofreading) Aktivität Die eingebauten Nukleotide werden auf Korrektheit übereprüft Eine Taq Polymerase baut im Mittel alle 9000 Nukleotide ein falsches Nukleotid ein - Qualitative Diagnostik - Quantitative Diagnostik - Genetischer Fingerabdruck Für 30 Reaktionszyklen ist demnach alle 300 bp ein Fehler zu erwarten Qualitative Diagnostik Qualitative Diagnostik Nachweis beispielsweise einer Viralen Infektion Theoretisch können alle Erreger mittels nachgewiesen werden. Vorraussetzung ist die Kenntnis über die Sequenz des Erregers, oder zumindest einen Teil davon, sowie die Konstruktion spezifischer Das Grundprinzip der kann hier klassisch sein Die kann auch zum Vergleich z.b. Diverser Genome dienen, deren Sequenz nicht vollständig bekannt ist! Behauptung: = Qualitative Diagnostik Qualitative Diagnostik Überprüfung der Hypothese, das Eichhörnchen eine ungewöhnliche Kaninchenart mit langem Schwanz und Vorliebe für Nüsse sind Technik: RAPD (random amplified polymorphic DNA analysis) Analyse zufällig amplifizierter polymorpher DNA mit Zufallsprimern ausführen So gewonnene Fragmente spiegeln die Gesamtstruktur der Matritzden-DNA wieder. Von genomischer DNA ausgehend erfährt man aus dem Bandenmuster etwas über das Genom Mit Zufallsprimern können Unterschiede im Genom zweier Lebewesen nachgewiesen werden.

11 Qualitative Diagnostik Qualitative Diagnostik Ist das Bandenmuster diverser Kaninchen ähnlich Unterschiedlich, wie das eines Eichhörnchens, könnte die Behauptung stimmen Kein Kaninchen = Qualitative Diagnostik Quantitative Diagnostik und Auswertung via Gelelektrophorese M - SYBR GREEN - Hybridization Probes (FRET) - Hydrolysis probes (Taqman) - Moleculare beacons SYBR GREEN SYBR GREEN Denaturierung SYBR GREEN binde an dsdna und fluoresziert dabei Keine Bindung an dsdna heißt keine Fluoreszens Hybridisierung Die Fluoreszens wird am Ende einer jeden Elongation gemessen und ist proportional der Menge an dsdna. Die Zunahme an dsdna kann live von Zyklus zu Zyklus verfolgt werden Elongation

12 Hybridization Probes (FRET) Aufbau Denaturierung FRET = Fluorescence Resonance Energy Transfer 2 Sonden werden eingesetzt Eine enthält einen Donor am 3 Ende, die Andere einen Akzeptor am 5 Ende Wird der Donor angeregt, kann er seine Energie an den Akzeptor weitergeben, wenn eine räumliche Nähe besteht Bekommt der Akzeptor Energie vom Donor, fluresziert er Hybridisierung Die Messung erfolgt am Ende des Hybridisierungsschrittes Hydrolysis probes (Taqman) Nutzt 5 3 ukleaseaktivität der Taq- Polymerase Wärend der Elongation werden Quencher und Fluorophore getrennt und Fluoreszenz kann gemessen werden Die Messung erfolgt wärend der Elongation Moleculare beacons Oligonukleotid mit Hairpin- Sekundärstruktur Ein Quencher ist am 3 Ende, ein Fluorophor am 5 Ende Bindet der Mol. Beacon an die Target DNA während der Hybridisierungsphase, entfernen sich Quencher und Fluorophor Fluoreszenz wird meßbar Typische Ergebnis einer Real-: Schmelzkurvenanalyse: Möglich bei: SYBR GREEN I FRET (Hybridization probes)

13 Schmelzkurvenanalyse generell: Schmelzkurvenanalyse für SYBR GREEN I Langsame Temperaturerhöhung am Ende der Regelmäßige Flureszenzmessung wärend dieses Vorgangs Das Schmelzverhalten kann so im geschlossenen Gefäß untersucht werden Der Schmelzpunkt (TM) eines Produkts ist spezifisch und bezüglich seiner Aussagekraft mit der Größe vergleichbar Wenn die dsdna denaturiert, wird SYBR GREEN I freigesetzt und die Flureszenz nimmt ab Mögliche Aussagen: Bestätigung eines Produktes Differenzierung zwischen spezifischen und unspezifischen Produkt (z.b. -dimers) Schmelzkurvenanalyse für FRET Quantifizierung der Wenn die dsdna denaturiert, nimmt die Flureszenz ab, wenn eine der Sonden freigesetzt wird Mögliche Aussagen: generell Mutationen Zwei generelle Möglichkeiten Absolute Quantifizierung Relative Quantifizierung Genotyping SNPs (Single Nucleotide Polymorphismus) Absolute Quantifizierung Absolute Quantifizierung Anwendungsgebiet z.b. Infektiöse Partikel zahlenmäßig nachzuweisen Durchführung mittels externem Standart externem Standart uns interner positiver Kontrolle

14 Relative Quantifizierung Relative Quantifizierung Anwendungsgebiet: Quantifizierung von mrna Expressions Stärke Durchführung mittels Zielgenkonzentration wird relativ der Konzentration eines Referenzgens (housekeeping gene) im selben Ansatz ausgedrückt. Eine Standartkurve wird genutzt, um eine Konzentration des Ziel- zum hauskeeping- Gen abzulesen Genetischer Fingerabdruck RFLP: Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus Kleinste Änderungen in einer DNA-Sequenz können einen RFLP bewirken Genetischer Fingerabdruck Alternativ zur Restriktionsanalyse und zum Einsatz von sonden, kann die verwendet werden. Hierbei kommen, oder Gemische zum Einsatz, die eine VNTR-Sequenz umlagern. VNTRs (variable number of tandem repeats) bestehen zumeist aus GTGTGT enthaltenden Sequenzen, wobei die Anzahl dieser Wiederhohlungen sehr variabel ist. Genetischer Fingerabdruck Jedes Individuum einer Population enthält an einem spezifischen Ort eine unterschiedliche Zahl dieser Wiederhohlungen Genetischer Fingerabdruck Die Wiederhohlungen varriieren zwischen 4 und 40 VNTRs werden auch als Mikrosateliten bezeichnet

15 Zusammenfassung Literaturempfehlungen Die dient der Vervielfältigung bestimmter Sequenzberreiche. Die Ergebnisse sind qualitativ (Gelelektrophorese) und quantitativ (real time) erfassbar Kostenlos, aber Englisch: Roche Applied Science Application Manual 2 nd edition ermöglicht vielfältige Anwendungen in Gentechnologie und Diagnostik by Roche Diagnostics GmbH, Mannheim s reserved. No part of this booklet may be reproduced in any form without written permission of the publishers. Literaturempfehlungen Literaturempfehlungen Kostenlos, aber Englisch: Teuer, aber gut: Literaturempfehlungen ENDE Teuer

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