Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik/Genomik

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1 Bioinformatik I: Grundlagen der Gentechnik/Genomik Prof. Dr. Antje von Schaewen ( und 14.01) Vertretung von Prof. Jörg Kudla (Freisemester) Institut für Biologie und Biotechnologie der Pflanzen Schlossplatz 7 jkudla@uni-muenster.de Schwerpunkte: 1. Werkzeuge der Gentechnologie (Enzyme) 2. Grundlegende Methoden der Gentechnologie 3. Vektoren, Klonieren und finden rekombinanter Klone 4. Reportergene, transgene Organismen und ihre Nutzung 5. Anwendungen der Gentechnologie Grundlagen der Genomik - Teil Kudla: Scripte Scripte: auf der Website der AG Kudla unter teaching Login: kurs Passwort: mars - Scripte bitte VOR der Vorlesung herunterladen - es stehen für jede Vorlesung drei inhaltlich identische Versionen im Netz: - 1.) 2 Folien pro Seite bunt (zum Anschauen) - 2.) 2 Folien pro Seite schwarz-weis (zum Ausdrucken) - 3.) 6 Folien pro Seite schwarz-weis (sparsame Druckversion) 1

2 Grundlagen der Gentechnik: Literatur und Scripte Literatur: 1. D. Nicholl: Gentechnische Methoden, Spektrum Verlag, 324 S., T.A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum, C. Mülhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics, Spektrum Verlag, Lodish et al.: Molecular Cell Biology, Freeman Verlag, Kapitel 9, ca. 72 NICHT: Jansohn, Gentechnische Methoden, Spektrum Verlag Klonierung: Das grundlegende Experiment der Gentechnologie Amp Selektion 2

3 Enzyme der Gentechnologie I. Nukleasen 1. Restrikonsendonukleasen 2. Exonukleasen II. Modifizierende Enzyme 1. Ligasen 2. Phosphatasen / Kinasen / Transferasen III. Polymerasen 1. DNA - Polymerasen 2. RNA - Polymerasen 3. reverse Transkriptasen Noch einmal: das 5 (-P) und das 3 (-OH) Ende! 3

4 Restriktionsendonukleasen - Entdeckt als restringierende Systeme bei Phageninfektionen - bestehen aus einer Nuklease- und einer Methylase-Aktivität Nomenklatur: Name des Organismus + Nummer des Restriktionsenzyms z.b.: Escherichia coli Enzym1 = Eco RI Serratia marcensens Enzym1 = Sma I Haemophilus influenzae Enzym3 = Hae III 3 Typen von Restriktionsenzymen sind bekannt Restriktionsendonukleasen Typ I: z. B. Eco B, Eco K, komplexe Nukleasen, zugleich Methylase und Nuklease benötigen ATP, Mg 2+ und S-Adenosylmethionin spezifische 15 bp Bindungsstelle, schneiden ca bp entfernt Typ III: z. B. Hga I, Hph I benötigen ATP, Mg 2+ nicht-palindromische Erkennungssequenz, schneidet ca. 5 bis 15 bp entfernt, bildet distinkte Fragmente 4

5 Restriktionsendonukleasen Typ II: z. B. Bam HI, Eco RI benötigen Mg 2+ palindromische Erkennungssequenz, meist 4-8 bp Bindungs- und Schnittstelle sind identisch hydrolytische Spaltung spezifische Puffer-Anforderungen (an ph und Salze) physikalische Kartierung (Restriktionskarten) Klonierung Southern-Blot Hybridisierung RFLP Analyse (Genkartierung) 3 Überhang 5 Überhang ohne Überhang 5 Überhang 5

6 Restriktionsendonukleasen - sticky ends bildet einzelsträngige Enden 3 -Ende OH-Gruppe 5 -Ende PO 4 -Gruppe Pst I: 5 -CTGCA/G-3 5 -CTGCA OH G/ACGTC-5 3 -G P -5 Eco RI: 5 -G/AATTC-3 5 -G OH CTTAA/G-5 3 -CTTAA P -5 Restriktionsendonukleasen - blunt & sticky ends glatte Enden: klebrige Enden: können beliebig kombiniert (ligiert) werden spezifische Basenpaarung nötig 6

7 Kombination gleicher Enden erlaubt die Ligation von unterschiedlichen Schnittorten manchmal geht die Erkennungssequenz verloren (Pfeil) Isoschizomere und Methylierungspaare Isoschizomere: gleiche Erkennungssequenz, schneiden gleich (Sst I, Sac I) Neoschizomere: gleiche Erkennungssequenz, schneiden unterschiedlich z.b.: Sma I Xma I CCC/GGG C/CCGGG GGG/CCC GGGCC/C Methylierungspaare: Enzyme mit gleicher Erkennungssequenz aber unterschiedlicher Methylierungsabhängigkeit z.b.: Sau 3A spaltet GATC und GA m TC Mbo I spaltet nur GATC Dpn I spaltet nur GA m TC 7

8 Schnittfrequenz von Enzymen hängt vom GC-Gehalt ab - 50%: Tetranukleotid 1/ bp Hexanukleotid 1/ bp Oktanukleotid 1/ bp aber: Frequenz eines Schnittortes (bei nur C+G) GC-Gehalt 50% Sma I, CCC/GGG 1/(4 6 x 4 2 ) bp GC-Gehalt 25% Sma I, CCC/GGG 1/(4 6 x 8 2 ) bp Aktivität von Restriktionsenzymen 1 Einheit (1 Unit, U): Eine Einheit eines Restriktionsenzyms ist die Menge Enzym, die 1 g DNA des Phagen in einer Stunde in speziellem Puffer bei 37 C vollständig verdaut. ABER: Zahl der Schnittstellen (Sal I: 2, Bcl I: 8, Cla I: 14) -DNA ist linear! Temperatur? 8

9 Wie pipettiere ich einen Restriktionsverdau? Volumen? DNA-Menge? Methylierung? Puffer? Temperatur? Besonderheiten? Enzymmenge? Reihenfolge (Nr.): x l DNA (3.) 2 l 10fach Puffer (2.) x l BSA? (4.) x l Enzym (5.) x l H 2 0 (1.) 20 l (total) II Modifizierende Enzyme - Ligasen - T4-DNA-Ligase (Bacteriophage T4): - verknüpft das 5 -Phosphatende mit der 3 -OH-Gruppe zweier DNA-Stränge (oder DNA + doppelsträngige RNA, oder zwei doppelsträngige RNAs) 9

10 II Modifizierende Enzyme - Ligasen - II Modifizierende Enzyme - Ligasen - - Ligation von DNA-Enden (z.b. PCR-Produkte in Vektor) - Verknüpfung von Bruchstellen ( Nicks ) in DNA -Mg 2+, ATP Ablauf: sticky-end Ligation: 10 min 1h, RT blunt-end Ligation: ÜN, 15 C 10

11 -Ablauf: sticky-end Ligation: 10 min 1h, RT blunt-end Ligation: ÜN, 15 C II Modifizierende Enzyme - Ligasen - II Modifizierende Enzyme - RNA Ligasen - T4-RNA-Ligase (Bacteriophage T4): single strand ligase - verknüpft das 5 -Phosphatende mit der 3 -OH-Gruppe einzelsträngiger DNA oder RNA - Ligation einzelsträngiger Nukleinsäuren - radioaktive 3 Markierung von RNA -ATP 11

12 II Modifizierende Enzyme - Phosphatasen - Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP, aus B. taurus): - Hydrolysiert die 5 -Phosphatgruppe von DNA, RNA, rntps, dntps - Dephosphorylierung von Vektorenden, um die Religationsrate zu reduzieren -Mg 2+ II Modifizierende Enzyme - Kinasen - T4-Polynucleotid-Kinase (PNK, T4 Bacteriophage): - Überträgt das -Phosphat von ATP auf das 5 -Ende von Nukleotiden - Phosphorylierung von PCR-Produkten - 5 -End Markierung von DNA, RNA und Oligonukleotiden -Mg 2+, ATP, reduzierendes Milieu (DTT, -ME = -Mercaptoethanol) 12

13 II Modifizierende Enzyme - Transferasen - Terminale Desoxynucleotidyltransferase (B. taurus): - hängt Nukleotide an freie 3 -OH Gruppen an - Homopolymerschwänze (die dadurch an DNA gekoppelt werden) - 3 -End Markierung von DNA -Mg 2+, dntps, III Polymerasen - DNA Polymerasen - DNA-Polymerase I, Holoenzym (E. coli): - DNA-abhängige DNA-Polymerase, 3 -Exonuclease (für doppel- und einzelsträngige DNA), 5 -Exonuclease (für doppelsträngige DNA) - Auffüllen von 5 -Überhängen, entfernen von 3 -Überhängen - Markierungen ( nick -Translation) -Mg 2+, Primer (bzw. freies 3 -OH) dntps (ohne dntps überwiegt die 3 -Exonucleaseaktivität!) 13

14 III Polymerasen - DNA Polymerasen - DNA-Polymerase I, Klenow Fragment (E. coli): - entspricht der DNA-Polymerase I, jedoch ohne 5 -Exonucleaseaktivität - auffüllen von 5 -Überhängen, entfernen von 3 -Überhängen - radioaktive Sequenzierung - cdna-synthese (Zweitstrang) -Mg 2+, Primer (bzw. freies 3 -OH) dntps (ohne dntps überwiegt die 3 -Exonucleaseaktivität) III Polymerasen - DNA Polymerasen - T4-DNA-Polymerase (T4 Bacteriophage): - DNA abhängige DNA Polymerase, 3 -Exonuclease - auffüllen von 5 -Überhängen - bevorzugt für das entfernen von 3 -Überhängen verwendet, aufgrund hoher Exonucleaseaktivität -Mg 2+, Primer (bzw. freies 3 -OH), dntps (ohne dntps überwiegt auch hier die 3 -Exonucleaseaktivität!) 14

15 III Polymerasen - Thermostabile DNA Polymerasen - DNA-abhängige Polymerasen, tolerant gegenüber hohen Temperaturen besonders geeignet für PCR Reaktionen, Sequenzierungen Name Organismus 5 -Exonuclease 3 -Exonuclease Produkt- Enden ( Proofreading ) Taq Pol. Thermus aquaticus ja nein 3 A Pfu Pol. Pyrococcus furiusus ja ja glatt Pwo Pol. Pyrococcus woesei ja ja glatt Phusion, Q5, etc. High fidelity & fast (recombinant) -Mg 2+, dntps, Primer (3 -OH Ende) ja ja glatt III Polymerasen - RNA Polymerasen - DNA-abhängige RNA-Polymerasen (T3, T7 Bacteriophage) - Synthetisieren RNA von einem DNA Template ohne Primer, distinkte Promotor Erkennungssequenzen - radioaktive Markierung von RNA (für Prozessierungsstudien) - Synthese von RNA (für in vitro Translationen) -Mg 2+, DTT oder -Mercaptoethanol, 15

16 III Polymerasen - Reverse Transkriptasen - M-MLV Reverse Trancriptase (Moloney Murine Leukemia Virus) - RNA-abhängige DNA-Polymerasen, 5 -Exoribonuclease (RNase H) - gibt es auch ohne RNase H, 3 -Exoribonuclease - Erststrangsynthese von cdna (RT-PCR Anwendungen) - Degradierung von RNA in RNA/DNA-Hybriden -Mg 2+, Primer Nukleasen Phosphodiesterasen = spalten Phosphodiester-Bindungen innerhalb von Nukleinsäuren Exonukleasen = spalten vom Ende (entweder 5 oder 3 ) einzelne Nukleotide ab Endonukleasen = spalten beliebig innerhalb der Nukleinsäure, bis nur kurze Oligonukleotide übrig sind 16

17 Nukleasen - DNA Exonukleasen - Nuklease Bal31 (Alteromonas espejiani): - doppel- und einzelsträngige 5 - bzw. 3 -Exonuklease - Schrittweise Verkürzung von DNA (z.b. wenn man Promotoren oder Bereiche, die von Proteinen gebunden werden analysieren will) -Ca 2+ und Mg 2+ Nukleasen - DNA Exonukleasen - Exonuklease III (E. coli): - doppelsträngige 3 -Exonuklease, besitzt auch RNAse H-Aktivität - Unidirektionale Deletionen (da 3 -Überhänge nicht angegriffen werden) - Herstellung von einzelsträngiger DNA -Mn 2+ und Mg 2+ 17

18 Nuklease SI (Aspergillus oryzae): Nukleasen - DNA Endonukleasen - - einzelsträngige DNA und RNA Endonukleaseaktivität - transcript mapping - glätten von DNA-Enden - generieren von Nicks in doppelsträngiger DNA - spalten von Hairpin-Strukturen -Zn 2+ und ph 4,5 DNase I (B. taurus): Nukleasen - DNA Endonukleasen - - einzel- und doppelsträngige DNA-Endonuklease, als auch RNA/DNA-Hybride - Degradation von DNA aus RNA Proben - DNase I footprinting (Proteine schützen) - Nick Translation -Mg 2+ für random nicks, in Anwesenheit von Mn 2+ wird auf beidseitig geschnitten 18