Gentechnik - Klonieren und Analysieren von Genen

Transkript

1 Gentechnik - Klonieren und Analysieren von Genen In den letzten Jahren wurden zahlreiche Methoden entwickelt, die es erlauben, das genetische Material nahezu beliebig zu verändern und gezielt neu zu kombinieren, und Gene, Erbkrankheiten, Verwandtschaften durch Analyse des genetischen Materials zu bestimmen.

2 Gentechnik - Restriktionsenzyme Das alles wäre nicht möglich gewesen ohne ein Geschenk der Natur, den Restriktionsendonucleasen, meist einfach Restriktionsenzyme genannt. Erst durch sie ist ein reproduzierbares Zerlegen des Erbmaterials und dadurch auch ein gezieltes Neukombinieren möglich.

3 Gentechnik - Restriktionsenzyme Eigentlich sind die Restriktionsendonucleasen als Teil des Restriktionssystems Bestandteile der Virusabwehr bei Bakterien. Der andere Teil des Systems sind DNAmodifizierende Enzyme, meist Methylasen. Diese verändern die bakterieneigene DNA (ohne die genetische Information zu ändern!). Fremd-DNA (z.b. Phagen-DNA) fehlt diese Modifizierung, die Endonuclease erkennt sie als fremd und zerschneidet sie. Jedes Restriktionssystem ist für eine bestimmte DNA-Sequenz spezifisch.

4 Gentechnik - Restriktionsenzyme Wird eine Phagen-DNA versehentlich methyliert, kann der Phage diesen Stamm ab jetzt ungestört infizieren. Stämme mit anderem Restriktionssystemen sind gegen ihn resistent (ihre Kennsequenz ist nicht methyliert), es besteht also eine Wirtsrestriktion.

5 Gentechnik - Restriktionsenzyme Die meisten Restriktionsenzyme erkennen kurze palindrome Sequenzen (also Sequenzen, die von vorn und hinten gleich lauten, bei DNA: beide Stränge tragen die gleiche Sequenz, z.b. 5 -GATC-3 ). Sie schneiden beide DNA-Strange der Sequenz selbst oder in der Nähe. Dabei können die beiden Schnitte versetzt liegen, das führt zu überhängenden ( protruding ends ) Enden (5 oder 3 -Überhänge), oder der Doppelstrang ist glatt durchgeschnitten ( blunt ends ). Die überhängenden Enden können miteinander paaren, sie sind also klebrig ( sticky ends ). NETTE PIPETTEN

6 Gentechnik - Restriktionsenzyme

7 Gentechnik - Restriktionsenzyme Die Länge der Kennsequenz ist meist 4 oder 6 Basenpaare. Je länger die Sequenz, desto weniger Schnittstellen kommen durchschnittlich vor: eine 4er-Sequenz (4 4 =2 8 ) kommt ca. alle 256 Bp vor (bei DNA mit 50% GC-Gehalt), eine 6er-Sequenz ca. alle 4096 Bp. NotI mit einer 8er-Kennsequenz schneidet selbst im menschlichen Genom nur wenige Male, produziert also sehr große Fragmente.

8 Gentechnik - Restriktionsanalyse Trennt man die DNA-Bruchstücke nach Restriktionsverdau nach ihrer Größe auf (durch Elektrophorese im Agarose-Gel) und macht sie sichtbar (nach Anfärben mit Ethidiumbromid, das in die DNA interkaliert = sich zwischen die gestapelten Basen schiebt, durch Fluoreszenz im UV-Licht, der UV- Lichtkasten wird Transilluminator genannt), sieht man ein Bandenmuster, das für das DNA-Stück ähnlich charakteristisch ist wie ein Fingerabdruck für den Menschen.

9 Gentechnik - Restriktionsanalyse Zur Gelherstellung kocht man Agarose, ein Polysaccharid aus Meeresalgen, mit Puffer (Wasser und Salze), beim Abkühlen erstarrt die Masse. Durch einen Kamm erzeugt man Taschen, in die man die Proben (gelöste DNA-Fragmente mit Bromphenolblau) einfüllt.

10 Gentechnik - Restriktionsanalyse Im elektrischen Feld wandern DNA (unsichtbar) und das Bromphenolblau, das anzeigt, wie weit die Trennung fortgeschritten ist.

11 Restriktionsanalyse - Bandenmuster im Agarosegel Große Fragmente wandern langsamer durch das Netzwerk aus Agarosesträngen und bleiben so nahe der Auftragstasche (hier: oben). Größe und Menge lassen sich durch Standarts (bekannte Proben) ermitteln.

12 Restriktionsanalyse Mit Größenstandards und kombinierten Verdaus mit mehreren Restriktionsenzymen läßt sich eine Restriktionskarte der DNA erstellen. Ist die Sequenz bekannt, kann die Karte leicht errechnet und die Bandenmuster vorhergesagt werden.

13 Hybridisierungstechniken Große DNAs (ganze Genome) geben so viele Restriktionsbanden, daß sie fast wie ein Schmier erscheinen und eine direkte Analyse nicht möglich ist. Durch Doppelstrangbindung von markierten DNAs (Sonden, Proben, probes ) lassen sich einzelne Banden der DNA sichtbar machen: Hybridisierung der beiden DNAs.

14 Southern-Blot Meist wird dazu die geschnittene (Restriktionsenzym) DNA elektrophoretisch aufgetrennt und die DNA mit Hilfe von Papierhandtüchern oder elektrophoretisch auf ein Nitrozellulosefilter übertragen (blot heißt saugen): Southern-Blot, nach dem Erfinder der Methode, Edwin M. Southern.

15 Southern-Blot Elektrophoretische Trennung

16 Southern-Blot Transfer (Blot), Hybridisierung und Detektion

17 Southern-Blot Bei Verwendung radioaktiver Proben ( 32 P, 35 S) erfolgt die Filmschwärzung in der Autoradiographie durch radioaktiven Zerfall. Neuerdings sind nicht-radioaktive Verfahren im Zunehmen, bei denen über ein Enzym eine Chemoluminiszenz (Licht durch chemische Reaktion) entsteht, die den Film schwärzt.

18 Southern-Blot

19 Southern-Blot Am besten hybridisieren genau passende DNA-Stränge. Durch Erniedrigen der Hybridisierungtemperatur kann man aber auch ähnliche Sequenzen detektieren. Das wird z.b. bei Zoo-Blots gemacht, bei denen man nach verwandten Sequenzen in den unterschiedlichsten Organismen sucht.

20 Northern-Blot Durch Hybridisierung läßt sich auch die Transkriptionsrate von Genen und damit deren Regulation ermitteln. Dabei wird isolierte RNA oder auch mrna (angereichert über die Poly-A-Schwänze) elektrophoretisch aufgetrennt, geblottet und mit einer DNA-Probe hybridisiert. Als Gegenstück zum Southern-Blot heißt das Northern-Blot (und die Hybridisierung von Proteinen mit Antikörpern Western- Blot). RNA ist viel labiler als DNA, daher erfordert ein Northern sorgfältiges und sauberes Arbeiten.

21 Genom-Arrays Die Expression vieler oder sogar aller Gene eines Organismus lassen sich mit Genom-Arrays oder Gen- Chips ermitteln. Dabei sind auf einem nur briefmarkengroßen Träger tausende von DNA-Proben aufgebracht, die von den verschiedenen Genen stammen.

22 Genom-Arrays Die zu untersuchende mrna (z.b. aus hitzegeschockter Hefe) wird in DNA revers umgeschrieben, mit einem Fluoreszenzfarbstoff (z.b. rot, Cy5) markiert und zur Hybridisierung eingesetzt. Gleichzeitig wird eine Kontrollpräparation (hier: mrna aus nicht-hitzebehandelter Hefe) mit einem anderen Farbstoff (z.b. grün, Cy3) markiert und gleichzeitig hybridisiert. Mit Lasern werden die winzigen Hybridisierungs- spots abgetastet und gemessen. Wichtig ist das Verhältnis der Fluoreszenzen: unveränderte Expression bewirkt Farbmischung (gelb), angeschaltete Gene erscheinen rot, abgeschaltete grün.

23 Genom-Arrays

24 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLM) Bei Erbkrankheiten sind häufig Restriktionsstellen im oder nahe dem mutierten Gen verändert. Eine Restriktionsanalyse des Bereichs (Schnitt, Trennung, Blot, Analyse mit Gensonde) zeigt dann über die veränderte Größe des Restriktionsfragments das Vorhandensein der Erbkrankheit.

25 Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus (RFLM) RFLP weist Sichelzellanämie nach:

26 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Durch die PCR lassen sich winzigste DNA-Mengen fast beliebig vervielfältigen. Dadurch kann man auch mit kleinen Probenmengen (Speicheltropfen, wenige Zellen einer Abschürfung...) genaue Analysen anfertigen oder Gene daraus isolieren. Die PCR wurde von Mullis (Chemie-Nobelpreis 1993) entwickelt. Sie besteht in der Wiederholung von drei Teilschritten, die zusammen zu einer Verdopplung eines DNA-Abschnitts führen:

27 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) -Denaturierung: bei 95 C trennen sich die beiden Stränge der DNA-Duplex - Annealing: durch schnelles Abkühlen auf ca. 55 C wird eine Renaturierung verhindert, kleine Oligonucleotide (Primer) lagern sich an komplementäre Abschnitte der Einzelstränge an - Extension: bei 72 C werden von hitzestabiler DNA-Polymerase (Taq- Polymerase) die Einzelstränge ausgehend von den Primern zu Doppelsträngen ergänzt

28 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Der Abschnitt zwischen den beiden Primern wird in jeder Runde verdoppelt, nach 20 Runden also theoretisch um x vermehrt, nach 40 Runden ca x (die wirklichen Werte liegen bei hoher Zyklenzahl deutlich tiefer). Der Prozeß findet automatisch in einem programierbaren Heizblock (Thermocycler) statt, der die verschiedenen Temperaturen ansteuert. Die Polymerase aus Thermus aquaticus denaturiert selbst bei 95 C nicht, muß also nicht neu zugegeben werden.

29 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bei der PCR lassen sich auch Restriktionsschnitte um den vermehrten Bereich anhängen, so dass das Stück anschließend leicht herausgeschnitten und kloniert werden kann.

30 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) PCR läßt sich auch dafür verwenden, gezielte Mutationen ( site directed mutagenesis ) in die vermehrte DNA einzubauen. Dabei verwendet man Primer mit kleinen Fehlern (Punktmutationen, Deletionen oder Insertionen gegenüber der Hybridisierungsstelle).

31 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Bei der DNA-Vermehrung durch PCR liegt die Fehlerrate etwas höher als bei der natürlichen Replikation. Besonders niedrig wird sie durch Verwendung von (besonders teurer) proof reading DNA-Polymerase. Andererseits läßt sich die Fehlerquote absichtlich erhöhen, indem man z.b. Manganionen in den PCR-Ansatz gibt (PCR-Mutagenese). Dadurch kann man schnell eine große Anzahl von Mutantenallelen (mit zufälligen Mutationen) aus einem klonierten Gen herstellen.

32 PCR zur Personenidentifizierung Die PCR ist ideal zur Identifizierung von Personen, z.b. bei der Feststellung einer Vaterschaft (50% der DNA von Vater und Kind sind identisch), oder der Überführung eines Verbrechers anhand von Speichel, Blut oder Sperma bzw. Identifizierung eines Opfers mit Knochenresten. Dabei verwendet man mehrere Primerpaare (die also jeweils zu zweit ein Fragment vermehren), die um Abschnitte herumliegen, die sich bei unterschiedlichen Menschen in der Länge unterscheiden (DNA-Polymorphismen). Das sind besonders die Mikrosatelliten, bei denen kurze Sequenzen (z.b. GA, GAG, CAA) häufig wiederholt sind. Die Zahl der Wiederholungen variiert und gibt daher verschieden lange Fragmente.

33 PCR zur Personenidentifizierung Das Bandenmuster in der Elektrophorese ist für jeden Menschen (außer eineiigen Mehrlingen und neuerdings geklonten Individuen) charakteristisch: genetischer Fingerabdruck

34 PCR zur Personenidentifizierung Die Auswertung dieses Bandenmusters hätte vor Gericht als Vaterschaftsbeweis eher keinen Bestand

35 DNA-Sequenzierung Die eigentliche genetische Information, die Basenabfolge einer DNA, wird durch Sequenzierung bestimmt. Das Verfahren ist unterdessen so weit automatisiert, dass ganze Genome in kurzer Zeit aufgeklärt werden können.

36 DNA-Sequenzierung Die verwendete Strategie beruht auf der Sequenziermethode von Sanger: Ausgehend von einem radioaktiv markierten Primer wurde die DNA in vier separaten Ansätzen zum Doppelstrang ergänzt (mit DNA-Polymerase und datp, dctp, dgtp, dttp). Die Ansätze enthielten je ein Didesoxy- Trinucleotid (ddatp, ddctp...) in kleinen Mengen. Wenn das eingebaut wurde (>kein 3 -OH vorhanden), konnte der Strang nicht weiter verlängert werden. In einem der Ansätze endeten alle Fragmente daher bei einem A, im zweiten bei C... Die vier Ansätze wurden nebeneinander elektrophoretisch getrennt und über Autoradiographie ausgewertet.

37 DNA-Sequenzierung Strangsynthese mit Abbruch durch Didesoxynucleotide nach Sanger

38 DNA-Sequenzierung Klassisches Sequenziergel:

39 DNA- Sequenzierung Für Sequenzierautomaten erfolgt die Markierung durch vier verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe, die Auswertung wird beim Vorbeilaufen der Fragmente (in der Elektrophorese) an einem Fluoreszenzdetektor vorgenommen.

40 DNA-Sequenzierung Das Ergebnis wird als Emissionsmuster dargestellt, aber zugleich auch schon als Basenreihenfolge ausgewertet.

41 DNA-Klonierung Zum Isolieren von Genen und zur Neukombination von genetischem Material wird zunächst das Ausgangsmaterial isoliert. Bei kleinen Probenmengen wird das gesuchte Gen mit PCR vermehrt. (Dabei lassen sich auch neue Restriktionsschnittstellen um das Gen herum anfügen.) Ist das Ausgangsmaterial RNA (dadurch fallen die Introns weg), muss es durch Reverse Transkriptase erst in DNA umgeschrieben werden.

42 DNA-Klonierung Durch Restriktionsenzyme wird das Gen herausgeschnitten und in ein gleich aufgeschnittenes* Plasmid, den Vektor durch Ligation (DNA-Ligase) eingebaut. *bei sticky ends müssen die Überhange paaren können, blunt ends passen immer zu anderen glatten Enden (ligieren aber schlechter).

43 DNA-Klonierung Das neuproduzierte Plasmid wird in kompetente (durch Vorbehandlung zur DNA-Aufnahme befähigte) E. coli transformiert. Auf dem Vektor ist meist ein Resistenzgen (beliebt ist bla - β-lactamase, Resistenz gegen Ampicillin). Transformanten wachsen daher auf Platten mit Ampicillin. Die Plasmide werden wieder isoliert. Durch Restriktionsanalyse wird der Einbau des richtigen Fragments nachgewiesen. Alle Zellen einer E. coli-kolonie nach der Transformation stammen aus einer Ausgangszelle (sind also ein Klon) tragen dasselbe Plasmid. Daher spricht man davon, dass das Gen auf dem Plasmid kloniert wurde.

44 DNA-Klonierung Der Vektor enthält neben dem Selektionsmarker (z.b. bla) auch einen Replikationsursprung (Origin), damit das Plasmid in der Zelle vermehrt wird. Zur Klonierung in andere Organismen (Hefe, Säugerzellen, Pflanzen) enthalten die Vektoren neben dem Teil für E. coli Selektionsmarker und Origin für den jeweiligen Zielorganismus. Vektoren für mehrere Organismen werden Shuttle-Vektoren genannt, da sie Pendelverkehr zwischen den Organismen ermöglichen.

45 DNA-Klonierung Damit man möglichst viel Auswahl an Restriktionsschnittstellen zum Klonieren hat, enthalten die meisten Vektoren eine Multicloningsite, MCS, einen kurzen Abschnitt, der viele verschiedene Restriktionsstellen enthält. Zugleich dürfen die entsprechenden Restriktionsendonukleasen den Vektor an keiner weiteren Stelle schneiden, sonst würde er sich nicht einfach (zur Aufnahme des anderen DNA-Fragments öffnen, sondern würde in zwei Teile zerfallen. Die Restriktionsstellen der MCS müssen also im Vektor einmalig sein, unique sites. puc18-mcs

46 Vektorkarte von puc18 und puc19

47 YEp24 - Hefe/E. coli- Shuttlevektor

48 Genexpression Um gezielt Proteine zu produzieren, werden die entsprechenden Gene in einen Expressionsvektor hinter einen starken, regulierten Promotor kloniert, z.b. den lac- Promotor (induzierbar mit IPTG). Zur Proteinproduktion werden die Zellen erst vermehrt, dann erst das Gen angeschaltet. So wird vermieden, daß das Fremdprotein in der Zelle mit der Zeit proteolytisch abgebaut wird. Durch die hohe Expression können die Chaperone der Zelle oft ein Verklumpen nicht verhindern. Dann entstehen inclusion bodies, Einschlußkörper aus denaturiertem Protein.

49 Genexpression Die Proteine können auch gezielt verändert werden, z.b. können einzelne Aminosäuren durch Änderung des Gens verändert werden (site directed mutagenesis, gezielte Mutagenese). Oder das Gen wird mit einem kurzen Stück verbunden, das eine Extradomaine an das entstehende Plasmid hängt (das Protein ist dann getagged ). So ein Tag kann als Isolierungshilfe dienen (His 6 -Tag, Anhängen von 6 Histidinresten, ermöglicht das Binden des Proteins an gebundene Nickel, Zink oder Kupferionen), oder das unsichtbare Protein sichtbar machen: durch Anhängen von GFP, green fluorescent protein, kann man das nun grün fluoreszierende Protein in der lebenden Zelle verfolgen.

50 Genbanken Genbanken (= Genbibliotheken) repräsentieren ganze Genome in klonierten Einzelstücken. Dazu werden die Genome durch Restriktionsschnitte oder mechanisch (Scherung) fragmentiert und in einen Vektor eingebaut. Daraus lassen sich dann einzelne Gene isolieren, z.b. durch funktionelle Komplementation von Mutanten. Beispiel: temperatursensitive S. cerevisiae Mutante der Zellzyklus-Proteinkinase CDC28 stirbt bei 37 C. Nach Transformation mit einer Hefe-Genbank überleben Zellen bei 37 C, die ein Fragment mit CDC28 tragen. Auch bei Transformation mit einer menschlichen Genbank lassen sich Überlebende bei 37 C isolieren. Hier enthalten die Plasmide die menschlichen Homologen der Proteinkinasegene.

51 Selektion von Transformanten

52 Genbanken Ob ein DNA-Abschnitt in einer Genbank wirklich vorhanden ( repräsentiert ) ist, liegt an der Größe des Ausgangsgenoms, der Anzahl der unterschiedlichen Plasmide in der Genbank, und dem Zufall. Damit ein menschliches Gen mit 99%iger Wahrscheinlichkeit in einer Genbank vorkommt, muß diese Bank verschiedene Fragmente des menschlichen Genoms von durchschnittlich 20 kbp Länge enthalten. (Achtung: wenn bei Fragmenten ein Gen mit 50% Wahrscheinlichkeit enthalten ist, ist es bei Fragmenten nicht mit 100% dabei, sondern mit 75%!! 100% Sicherheit sind so nie zu erreichen).

53 Genbanken Außer durch Schneiden der genomischen DNA (Genomische Bank) kann eine Genbank auch durch reverses Transkribieren von mrna in cdna und deren Ligation in Vektoren erzeugt werden (cdna-bank). Ein Vorteil der cdna-bank für die Suche nach Genen ist es, dass die Introns wegfallen. Außerdem werden bei genomischen Banken Gene oft zerschnitten. Dafür sind bei genomischen Bänken alle Stücke etwa gleich wahrscheinlich, während bei cdna-banken einige Gene sehr häufig vorkommen, andere gar nicht. Bei cdna-banken kommt es darauf an, aus welcher Wachstumsphase (Hefe: auf Glucose gezogen, stationär, unter Sauerstoffstreß) bzw. aus welchem Gewebe die mrna stammt (Mensch: Leber, Tumor, embryonale Nervenzelle gegen erwachsene Nervenzelle).

54 Gene in der lebenden Zelle gezielt ver!ndern: Genome-Editing mit dem CRISPR/Cas-System Das CRISPR/Cas-System entstammt einem adaptiven antiviralen Abwehrmechanismus aus Bakterien, dem CRISPR. Eine Endonuklease (Cas9) wird mit einer RNA (crrna spacer) zur komplementären DNA-Sequenz geleitet und schneidet da basengenau. In die Lücke kann zugegebene DNA eingebaut werden. Die Methode, entdeckt von Emmanuelle Charpentier und Jennifer Doudna, dürfte in Zukunft in der menschlichen Gentherapie eine zentrale Rolle spielen.