Gentechnik. H. Appelhans - V. Eckert - C. Friemert-Flotow. Einführung in Prinzipien und Methoden. Herausgegeben von Hans Günter Gassen, Andrea Martin

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1 2008 AGI-Information Management Consultants May be used for personal purporses only or by libraries associated to dandelon.com network. Gentechnik Einführung in Prinzipien und Methoden Herausgegeben von Hans Günter Gassen, Andrea Martin und Sabine Bertram Unter Mitarbeit von H. Appelhans - V. Eckert - C. Friemert-Flotow G. Klock - K. Schollmeier - W. Schumann 178 Abbildungen und 33 Tabellen Gustav Fischer Verlag -

2 Inhalt 1 Kurzer überblick über Prinzipien und Ziele der Gentechnik (Hans Günter Gassen) Daten zur Geschichte der molekularen Biologie Programm. Überträger und Wirtszelle Die Klonierung eukaryontischer Gene Die Konstruktion von Expressions-Plasmiden Der umgekehrte Weg: Vom Protein zum Gen Der Beitrag der Chemie zur Gentechnik Ziele der Gentechnik: Machbares oder Träume Mit mehr Wissen sollte auch der Mut zu mehr Verantwortung wachsen Allgemeine Literatur zur Gentechnik Morphologie und Funktion von Zellen (Volker Eckert) Die Unterteilung in Pro- und Eukaryonten Struktur und Eigenschaften der Eubakterien Die Struktur eukaryontischer Zellen Endoplasmatisches Reticulum Golgi-Apparat und Dictyosomen Lysosomen Sphärosomen Mitochondrien Mikrotubuli. Geißeln und Cilien als gemeinsame Strukturen der Eukaryonten Die tierische Zelle Komplexe Nährstofbedürfnisse <<Kontaktbedürfnissen Kontaktinhibierung Mechanische Labilität Limitierte Zellteilungszahl... 50

3 VIII. Inhalt 2.5 Krebszellen Die pflanzliche Zelle Die Pilze Literatur I Nucleinsäuren und Proteine als molekulare Komponenten der Zelle (Constanze Friemert) Die ungewöhnlichen Eigenschaften des Mediums Wasser Die Chemie der Nucleinsäuren Nucleinsäuren und ihre Bausteine Die Konformation der DNA Die Konformation der RNA Das Wechselspiel zwischen Einzel- und Doppelstrang Eine Zusammenfassung der Nomenklatur. der Abkürzungen und Symbole in der Nucleinsäurechemie Nucleotide als Bausteine anderer Biomoleküle Die Chemie der Aminosäuren und Proteine Aminosäuren Die Peptidbindung Die Raumstruktur der Proteine Prozessierung von Proteinen Glykoproteine Literatur Der genetische Apparat von Lebewesen (Sabine Bertram) Einleitung Die Replikation der DNA Die Transkription der DNA in mrna-moleküle Die Transkription der DNA in rrna- und trna-moleküle Der genetische Code Die Translation der mrna in Proteine trna. Aminoacryl-tRNA und Ribosomen Die Initiation als Startreaktion der Translation

4 Inhalt. IX \ Die Elongation als schrittweise Verlängerung der Peptidkette Die Termination, das Ablösen des Proteins vom Ribosom Die Regulation der Translation Sekretion von Proteinen Literatur Das Enzymrepertoire der Gentechnologen: Restriktionsendonucleasen und andere Enzyme (Klaus Schollmeier) Allgemeines Restriktionsendonucleasen Fragmentierung der DNA durch Restriktionsenzyme Anwendung der Restriktrionsenzyme auf die in-vitro-neukombination von DNA DNA-Methylasen zum Blockieren von Restriktionsstellen Kinasen und Ligasen, Enzyme zur Reparatur des DNA-Doppelstranges , DNA-Polymerasen: Vom Einzelstrang zum Dopp elstrang Methoden zur radioaktiven Markierung von DNA: «nick»-translation und Auffüllreaktionen RNA-abhängige DNA-Polymerase: Die <<reverse Transkriptase<< , Einzelstrang-synthetisierende Polymerasen: poly(a)-polymerase und terminale Desoxynucieotidyltransferase Die katabolischen Nucleinsäure-Enzyme: Nucleasen und Phosphatasen Rekonstruktion von Restriktionsstellen als Beispiel für die gemeinsame Anwendung mehrerer Enzyme 155 Literatur Vektoren für die Übertragung der genetischen Information (Wolfgang Schumann)......, Bakteriophagen als Vektoren

5 X. Inhalt Der temperente E. coli-phage Lambda Der virulente Einzelstrang-Phage M Plasmide als Vektoren Cosmide als Vektoren Vektoren zur Transformation animaler Zellen Das Ti-Plasmid als Vektor zur Transformation von Pflanzenzellen Literatur Die Suche nach dem richtigem Klon (Hans Günter Gassen) Die Suche nach Transformanten Insertions-Inaktivierung (<<insertional inactivation>>). 189 Methoden. die auf einem geänderten. Genotyp beruhen Die Koloniehybridisierung und die Analyse nach Southern Restriktionsanalyse positiver Klone Hybrid-arretierte und Hybrid-Freisetzungs-Translation Identifizierung von Klonen anhand der Genprodukte Immunologische Nachweismethoden zur Identifizierung spezifischer Translationsprodukte Literatur Anlage von Genbibliotheken (Heribert Appelhans) Die genomische Genbibliothek Die eukaryontische DNA A-Charon-Vektoren für Genbanken Konstruktion rekombinierter DNA Die cdna-genbank Einzelschritte zum Aufbau einer cdna-genbank Synthese komplementärer DNA Synthese des zweiten DNA-Stranges Aufschneiden der Schleife Verlängerung der 3'-Enden Präparation des Plasmides zur Insertion der cdna. 214

6 Inhalt. XI Transformation von Wirtszellen Literatur Wege zur Erhöhung der DNA- und Proteinausbeute (Gerd Klock) Einleitung Erhöhung der Gendosis durch Multicopy-Plasmide. 218 Multicopy-Plasmide als Vektoren Runaway-Plasmide als Vektoren Erhöhung der Genexpression durch Fusion des Strukturgens an regulierbare Promotoren Die Nutzung des P. Promotors des Phagen A zur Überproduktion bakterieller Proteine Der lac-promotor: Synthese von Human-Insulin durch Genfusion an das lacz-gen Der trp-promotor: Expression von Human- Leukozyten-Interferon durch Fusion an eine Shine-Dalgarno-Sequenz Sekretion von Human-Leukozyten-Interferon durch Bacillus subtilis Literatur Sequenzbestimmung von Nucleinsäuren und Proteinen (Hans Günter Gassen) Die DNA-Sequenzierung Das Maxam-Gilbert-Verfahren Die Sequenzierungsmethode nach Sanger Die Sequenzierung von Ribonucleinsäuren Proteinsequenzierung. das Comeback einer alten Methode Die Fragmentierung von Proteinen Proteinsequenzierung: der Edman-Abbau Literatur Chemische Synthese von DNA-Fragmenten (Hans Günter Gassen) überblick Phosphotriester- und Phosphitmethode. die neuen Konzepte in der DNA-Synthese

7 XI1. Inhalt Festphasensynthesen von Oligonucleotiden: Die Synthese am polymeren Träger Automaten zur Gensynthese Oligonucleotidsynthesen nach der Papierfiltermethode Die Enzyme zur DNA-Synthese Die Reinigung und Charakterisierung der DNA-Fragmente Die Verwendung kurzer DNA-Fragmente in der Gentechnik Die chemische Synthese von Strukturgenen Die gerichtete Mutagenese Die chemische Synthese von RNA-Fragmenten definierter Sequenz Literatur Vom Protein zum Gen. der Weg zurück (Hans Günter Gassen) überblick Isolierung und partielle Sequenzierung eines Proteins im nmol-maßstab Konstruktion der Gensonden Sequenzierung des Strukturgens Überproduktion des Proteins mit Hilfe eines Expressionsplasmids Literatur Wirtssysteme für neukombinierte DNA (Hans Günter Gassen) Einleitung Klonierung in Streptomyceten Vektoren für Streptomyceten Klonierung in Hefen Transformation von Hefen Vektoren für Hefen Mikron-Plasmide als Vektoren Genklonierung und Genexpression in höheren Zellen Einleitung Das Einschleusen fremder DNA in Säugerzellen.. 317

8 Inhalt. XI Die Thymidinkinase als Markergen Kotransformation mit nicht-selektionierbaren Genen Die Expression transformierter Gene in Säugerzellen Die Expression bakterieller Gene in Saugerzellen Die Transformation von humanen Lesch-Nyhan-Zellen Literatur Anwendungsbereiche der Gentechnik (Hans Günter Gassen) Hochgespannte Erwartungen und Bio-Pessimismus Gentechnik und die industrielle Mikrobiologie Die biologische Produktion von Chemie-Zwischenprodukten Gentechnik und Medizin Literatur Erbgut und Gentechnik (Hans Günter Gassen) Allgemeines Tiere spielen für den Menschen eine Vorreiterrolle Diagnose von Erbkrankheiten durch Chromosomenanalyse Möglichkeiten der Gentherapie Literatur Gefahren und Sicherheitsrisiken gentechnischer Forschung (Hans Günter Gassen) Schutzbestimmungen Tabellen Literatur Glossar Sachregister