Restriktion und Gentechnik

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1 Restriktion und Gentechnik

2 Einteilung 1.) Restriktion - Restriktionsenzyme - Southern Blotting 2.)Gentechnik - sticky ends - blunt ends

3 Restriktion Grundwerkzeuge der Gentechnik - Restriktionsenzymanalyse - Blottingtechniken - DNA-Sequenzierung - Polymerasenkettenreaktion (PCR)

4 Restriktionsenzyme - Restriktionsenzyme = Restriktionsendonucleasen - präzise molekulare Skalpelle sie schneiden die DNA-Doppelhelix an spezifischen Stellen

5 Nutzen von Restriktionsenzymen - Chromosomenstruckturanalyse - Sequenzierung von DNA-Molekülen - Isolierung von Genen - Erzeugung neuer DNA-Moleküle (anschließende Klonierung)

6 Wo findet man Restriktionsenzyme? - Sie sind in vielen Prokaryonten vorhanden - Ihre Aufgabe ist das spalten fremder DNA (eigene DNA ist durch Methylierung der Erkennungsstellen geschützt)

7 Funktionsweise von Restriktionsenzymen - Erkennen spezifischer Sequenzen aus 4 bis 8 bp - Spaltung der Phosphodiesterbindung bei jedem Strang - Sequenzen sind häufig Palindrome (Madam, I m Adam)

8

9

10 Trennung von Restriktionsfragmenten Trennung durch Gelelektrophorese - Laufstrecke ist umgkehrt proportional zum log der Basenpaare - Trennung ähnlicher DNA-Moleküle - Polyacrylamidgele (bis 1000bp), Agarosegele

11 Fingerprint eines DNA-Moleküls Durch die Nutzung mehrerer Restriktionsenzyme können ganze Chromosomen in kleine Fragmente gespalten werden und anschließend kartiert werden

12 Sichtbar machen von Banden - Autoradiographie bei radioaktiv markierter DNA - Anfärben des Gels mit Ethidiumbromid (DNA fluoresziert orange)

13 Southern Blotting - DNA Blotting - Methode, um ein bestimmtes Fragment unter vielen aufzuspüren - analoges Verfahren mit RNA-Molekülen nennt sich Northern Blotting

14 Southern Blotting 2 - Restriktionsfragmente mittels Gelelektrophorese trennen - denaturieren der DNA zu Einzelsträngen - überführen auf Nitrocellulosemembran - mittels 32P-markierter Sonde komplementäre Sequenzen hybridisieren - gesuchtes Fragment ist autoradiographisch sichtbar

15

16 RFLP-Analyse Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus - Vererbung ausgewählter Genen kann verfolgt werden - Mutationen an Restriktionsstellen verändern die Länge der Restriktionsfragmente -Nachweis von Erbkrankheiten (Sichelzellanämie, cystische Fibrose)

17 Gentechnik - Herstellung neuer Kombinationen nicht verwandter Gene im Labor - dauerhafte Veränderung der genetischen Ausstattung eines Wirtes

18 Klonieren - Bedeutet: in hoher Anzahl vervielfältigen -Einbringen von Genen in passende Zellen, wo sie vom DNA-Syntheseapparat des Wirtes repliziert werden

19 Neue DNA-Moleküle im Labor - Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden - Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden - DNA-Molekül mit komplementären Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA- Ligase verknüpfen

20 Vektoren - Vektoren haben die Eigenschaft sich in einem passenden Wirt autonom zu replizieren. - Besonders geeignet sind Plasmide und der Bakteriophage λ

21 Neue DNA-Moleküle im Labor - Interessantes DNA-Fragment kovalent an einen Vektor binden - Vektor an spezifischer Stelle mit einem geeigneten Restriktionsenzym schneiden - DNA-Molekül mit komplementären Ende in den Vektor einbauen und mittels DNA- Ligase verknüpfen

22 Vektor DNA-Fragment

23 Kohäsive Enden (sticky ends) - Durch versetzte Schnittstellen entstehen zueinander komplementäre Einzelstränge mit spezifischer Affinität zueinander - Man erhält die gleichen kohäsiven Enden durch Verwendung gleicher Restriktionsenzyme bei Vektor und DNA-Fragment

24 Vektor DNA-Fragment

25 Glatte Enden (blunt ends) - Auf diese Weise lassen sich an nahezu jedes DNA-Molekül kohäsive Enden anfügen - Einen DNA-Linker (chemische synthetisiertes Verbindungsstück) kovalent mit den Enden des DNA-Fragmentes verknüpfen - kohäsive Enden durch Einsatz geeigneter Restriktionsenzyme

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