Genklonierung. Die Schritte der Genklonierung. Die Schritte der Genklonierung im Ueberblick:

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1 Genklonierung Hinweis: Im Atelier finden Sie die CD "Gentechnik, interaktiv experimentieren". Sie betreten (vituell) das Biozentrum Basel und führen dort ein Klonierungsexperiment durch. Die Schritte der Genklonierung DNA kann leicht aus eukaryotischen und prokaryotischen Zellen isoliert werden. Die Isolierung von DNA stellt den ersten Schritt im Arbeitsprozess einer Gen-Klonierung dar. Die Klonierung eines Gens wiederum ist die Voraussetzung für dessen weitere Analyse, denn durch Klonieren kann eine DNA in reiner Form gewonnen und vermehrt werden. Die Schritte der Genklonierung im Ueberblick: 1

2 Isolation von DNA (genomisch oder cdna) und Plasmid-DNA Schneiden der DNA und des Plasmids mit einem Restriktionsenzym Ligation von DNA-Fragmenten mit der Plasmid-DNA Transformation von Bakterien mit rekombinantem Plasmid Selektion von Bakterienklonen, welche ein Plasmid aufgenommen haben Isolierung des Klons mit dem gesuchten DNA-Fragment Hinweis: Sehen Sie sich den Film Prinzip der Genklonierung in der Video-Ecke an. Die einzelnen Schritte werden unten ausführlich beschrieben: 1. DNA Klonierung: Warum? Klonierung von genomischer DNA Die totale DNA von Zellen der selben Art wird in Stücke geschnitten und jedes Stück kloniert. Es resultiert eine Sammlung von DNA-Fragmenten, welche das ganze Genom dieser Zellen repräsentieren: die genomische DNA-Bank. Sie eignet sich zur Isolation von Genen (mit Promoter, Introns etc.) und intergenischen DNA-Sequenzen. Klonierung von cdna Die totale mrna von Zellen der selben Art wird isoliert, in cdna umgeschrieben und jede cdna kloniert. Es resultiert eine Sammlung von cdna-fragmenten, welche die gesamte mrna dieser Zellen repräsentieren: die cdna-bank. Sie eignet sich zur Isolation von DNA- Abschnitten, welche für Eiweisse kodieren. Da die kodierenden Sequenzen eines Genoms in der Regel nur wenige Prozente der gesamten DNA einer Zelle darstellen, sind cdna-banken viel kleiner (weniger Klone) als genomische Banken und eine gewünschte (für Eiweiss kodierende) DNA-Sequenz kann daher mit weniger Aufwand gefunden werden. 2. DNA-Isolierung Genomische DNA Die wichtigsten Schritte: Zellen aufbrechen. Physikalisch: z.b. zerstossen der gefrorenen Zellen im Mörser. Chemisch: z.b. Zell-Lyse mit Detergenzien Abzentrifugieren von unlöslichen Zelltrümmern Reinigen der DNA. Abbau von Proteinen mit Proteasen. Denaturieren und Ausfällen der Proteine mit Phenol. Die Nukleinsäuren bleiben in Lösung. Auftrennen von unlöslicher und löslicher Fraktion durch Zentrifugation. Ribonuclease-Behandlung zum Abbau von RNA. Anreichern der DNA mittels Ethanol- oder Isopropanolpräzipitation Hinweis: Sehen Sie sich den Film DNA-Isolation in der Video-Ecke an. Details zur DNA- Isolation finden Sie in der aufgelegten Broschüre. 2

3 cdna cdna (komplementäre DNA) ist ein "Abdruck" der mrna und entspricht der DNA, welche für eine gesuchte mrna codiert. Die wichtigsten Schritte: Isolation aller RNAs einer Zelle, in der das gesuchte Gen exprimiert, d.h. das Protein synthetisiert wird. Reinigung von mrna (d.h. Abtrennen von trna und rrna) durch Affinitätschromatographie Synthese eines komplementären DNA-Stranges auf der mrna-matrize: -> RNA-DNA- Doppelstrang Abbau des RNA-Stranges Synthese eines komplementären DNA-Stranges auf der DNA-Matrize: -> cdna (DNA- Doppelstrang) Vorgehen: Isolierung der gesamten zellulären RNA (80% rrna, 15% trna, 5% mrna) Abtrennen einer Fraktion, die hauptsächlich mrna enthält. Praktisch jedes mrna-molekül hat an seinem 3'-Ende eine Abfolge von Adenin-Nucleotiden = Poly (A)-Schwanz. Dieser eröffnet einen sehr bequemen Weg, mrna von der restlichen Zell-RNA zu trennen. Man bindet Desoxythymidin-Oligonucleotide ("Oligo(dT)") an Zellulose und füllt diese in eine Säule. Lässt man die gesamte Zell-RNA durch diese Säule laufen, bleiben die mrnas mit ihren Poly (A)-Schwänzen an den Oligonucleotiden "hängen" (Bildung von A-T- Basenpaaren), während die übrigen RNAs die Säule passieren. Nun lässt man einen Puffer niedriger Ionenstärke durch die Säule laufen. Dadurch lösen sich die Poly(A)-Oligo(dT)- Hybride auf, und die gereinigte mrna fliesst aus der Säule ab. cdna-synthese. Man gibt kurze Desoxythymidin-Oligonukleotide zu der gereinigten mrna. Diese hybridisieren mit den Poly (A)-Schwänzen und wirken dann als Primer für die Reverse Transcriptase, ein Enzym aus Retroviren. Mit Hilfe dieses Enzyms werden mrnas über RNA-DNA-Doppelstränge zuerst in einzelsträngige DNAs und darauf in doppelsträngige DNAs überschrieben. cdnas enthalten, wie Gene, die Information zur Bildung von Proteinen, haben aber im Gegensatz zu Genen keine Introns. 3

4 3. Plasmid-Isolierung Plasmide sind sich autonom vermehrende bakterielle Minichromosomen. Sie werden als Vektoren beim Klonieren benutzt. Vorgehen: Plasmidhaltige Bakterien in einem Flüssig-Medium züchten. Bakterien mit Lysozym behandeln, um die Zellwand zu destabilisieren. Bakterien mit Detergens lysieren und im alkalischen ph bakterielle DNA und Proteine denaturieren. Das Homogenat neutralisieren. Dabei fallen Proteine und bakterielle genomische DNA aus und die Plasmide bleiben in Lösung. Durch Zentrifugation Plasmide vom ausgefällten Material trennen. Die Plasmide mit organischen Lösungsmitteln extrahieren und mit Alkohol ausfällen. Hinweis: Sehen Sie sich den Film Plasmid-Isolierung im Labor in der Video-Ecke an. Aufgabe: Warum wird die bakterielle genomische DNA denaturiert und die Plasmide bleiben in Lösung? Lösung: S. 11 Hinweis: Im Atelier gibt es ein Modell, an welchem diese Vorgänge veranschaulicht werden. 4. Restriktionsendonucleasen Restriktionsendonucleasen sind Enzyme, welche DNA sequenzspezifisch spalten: 4

5 Restriktionsenzyme werden benötigt, um DNA an bestimmten Stellen zu zerschneiden. Sie erkennen spezifische Sequenzen von 4 bis 6 Nucleotiden und spalten dort die Phosphodiesterbrücken. Sie können DNA glatt inmitten ihrer Erkennungsstelle spalten und so stumpf endende Fragmente erzeugen. Andere schneiden den Doppelstrang versetzt, so dass kurze Einzelstrang-Schwänze mit spezifischer Sequenz entstehen ("klebrige" Enden). Durch Ligation können die einzelnen Fragmente untereinander verbunden werden. Heute kennt man über 800 verschiedene Restriktionsenzyme mit unterschiedlichen Erkennungssequenzen. Diese Enzyme können je nach Bedarf bei entsprechenden Firmen eingekauft werden. Restriktionsenzyme werden aus Mikroorganismen gewonnen. Beispiele einiger häufig benutzter Restriktionsenzyme und ihre Erkennungssequenzen: Enzym Erkennungssequenz Organismus Form der Enden Pvul CGATCG Proteus vulgaris klebrig Pvull CAGCTG Proteus vulgaris glatt EcoRl GAATTC Escherichia coli klebrig BamHl GGATCC Bacillus amyloliquefaciens klebrig Hinfl GANTC Haemophilus influenzae klebrig Sau3A GATC Staphylococcus aureus klebrig HaeIII GGCC Haemophilus aegyptius glatt Die angegebene Sequenz entspricht der eines Stranges in der 5'-3'-Richtung. Bemerkenswert ist, dass fast alle Erkennungssequenzen Palindrome sind: Wenn man beide Stränge betrachtet, lesen sie sich in beiden Richtungen gleich, zum Beispiel: Biologische Bedeutung der Restriktionsenzyme Mikroorganismen benutzen Restriktionsenzyme als "Abwehrmechanismus", um sich vor dem Eindringen fremder DNA zu schützen. Gelangt fremde DNA, beispielsweise durch eine Phagen- Infektion, in ein Bakterium, wird diese durch die Restriktionsenzyme der Zelle in kleine, funktionslose Fragmente zerlegt. Hinweis: Informationen über Bakteriophagen und Viren eukaryotischer Zellen finden Sie am Ende dieses Dokumentes. Die verschiedenen Typen von Restriktionsenzymen Es gibt drei Typen von Restriktionsendonucleasen, die man mit I, II und III kennzeichnet. Die Typen I und III sind im allgemeinen grosse Enzym-Komplexe aus vielen Untereinheiten mit sowohl Endonuclease- als auch Methylase-Aktivität. Restriktionsendonucleasen des Typ I spalten die DNA an zufälligen Stellen, die sich 1000 Basenpaare oder weiter von der Erkennungssequenz entfernt befinden können. Die Enzyme des Typs III spalten die DNA etwa 25 Basenpaare von der Erkennungssequenz entfernt. Beide Enzymtypen bewegen sich in einer Reaktion, die ATP- Energie verbraucht, an der DNA entlang. Die Restriktionsenzyme des Typs II, die zuerst von Hamilton Smith isoliert wurden, sind einfacher, erfordern kein ATP und spalten die DNA innerhalb der Erkennungssequenz. 5

6 Die aussergewöhnliche Nützlichkeit der Typ-II-Enzyme wurde zuerst von Daniel Nathans aufgezeigt. Sie sind die bei Arbeiten mit rekombinierter DNA am häufigsten verwendeten Enzyme. Nomenklatur der Restriktionsenzyme Die ersten Buchstaben stehen für den Namen des Organismus, aus welchem das Enzym isoliert wird. Die vierte Ziffer gibt an, um welchen Stamm es sich handelt. Dort, wo mehr als ein Restriktionsenzym in einem Stamm gefunden wurde, werden diese mit römischen Zahlen numeriert. Bsp. Eco RI ist das erste Restriktionsenzym, das in E. coli aus dem Stamm R isoliert wurde. Hinweis: Am Geschichtsposten im Atelier finden Sie Originaldokumente zu Restriktion und Modifikation. 5. Ligation Unter Ligation versteht man das Verknüpfen von DNA-Fragmenten mit dem Enzym DNA- Ligase: 6

7 DNAs mit komplementären einzelsträngigen Enden können über diese Basenpaarung eingehen. Sie werden deshalb als kohäsiv oder klebrig bezeichnet. Ueber diese Enden können DNAs durch die DNA-Ligase fest verbunden werden. Die DNA-Ligase katalysiert die Bildung neuer Phosphodiesterbrücken. Da Basenpaarung nur zwischen komplementären Sequenzen möglich ist, können von einem Restriktionsenzym erzeugte kohäsive Enden nicht mit den von einem anderen Enzym erzeugten Enden paaren, es sei denn, dieses andere Enzym erzeugt die gleichen klebrigen Enden. Doch zwei beliebige, von demselben Enzym erzeugte Fragmente können, ungeachtet ihrer unterschiedlichen Herkunft, miteinander "verkleben". Die Ligation wird bei 10 bis 15 o C durchgeführt. Bei dieser relativ tiefen Temperatur ist gewährleistet, dass die beiden komplementären Enden Basenpaare ausbilden und das Enzym (Ligase) noch arbeitet. Vorbereitung von cdna für die Ligation Weil die doppelsträngige cdna stumpfe Enden hat, muss auch das Plasmid stumpf geschnitten und cdna und Plasmid stumpf ligiert werden. Da dies nicht sehr effizient geht, werden oft Linker verwendet. Linker sind kleine doppelsträngige DNA-Stücke mit bekannter Sequenz (Restriktions- Schnittstellen), die man im Reagenzglas synthetisiert hat. Die Linker werden mit Hilfe der DNA- Ligase an die doppelsträngige cdna geknüpft und mit einem Restriktionsenzym geschnitten. Die cdna, die nun klebrige Enden hat, baut man in einen Vektor ein, der zuvor mit demselben Enzym geschnitten wurde: 6. Transformation Unter Transformation, im Zusammenhang mit rekombinanter DNA, versteht man das Einbringen von DNA in eine Zelle. Hinweis: Hier werden nur Bakterien betrachtet. Für höhere Zellen, siehe Methoden des Gentransfers beim Menschen. Wie bringt man DNA in lebende Zellen? Kompetente Bakterien Die meisten Bakterien, darunter auch E.coli, nehmen DNA unter normalen Bedingungen nur in begrenztem Umfang auf. Um diese Bakterien wirksam zu transformieren, muss man die Zellen 7

8 physikalisch und/oder chemisch behandeln. So wird ihre Fähigkeit verstärkt, DNA aufzunehmen. Zellen, die eine solche Behandlung durchlaufen haben, bezeichnet man als kompetent. Transformation von Bakterien Um DNA in E.coli-Zellen einzubringen, muss die Zellmembran für Makromoleküle permeabel gemacht werden. Dazu inkubiert man die Bakterienzellen mit Kalziumchlorid (CaCl2) bei 0 o C. Aus nicht vollständig bekannten Gründen werden die so behandelten Zellen "kompetent", d.h. sie nehmen bei 0 o C DNA auf. Dieser Vorgang ist sehr ineffizient, denn nur jede tausendste Zelle wird transformiert. Durch einen Hitzeschock bei 37 bis 43 o C wird die Aufnahme von DNA gestoppt. 7. DNA-Banken Genomische Banken Nun werden die transformierten Zellen auf einem mit Antibiotika behandelten Nährmedium ausgestrichen und mittels Inkubation bei 37 o C vermehrt. Auf diesem Nährmedium können nur diejenigen Bakterien überleben, die das Resistenzgen für das Antibiotikum besitzen und somit ein Plasmid aufgenommen haben. Aus jedem Bakterium entsteht so ein Klon. Merke: Ein Klon ist eine Gruppe oder Kolonie von genetisch identischen Organismen. Eine Genbank ist eine Sammlung von Klonen, die mit grosser Wahrscheinlichkeit jedes Gen eines bestimmten Organismus enthalten. Wenn die DNA von einem Säugetier mit einem Genom aus 3 x 10 9 Basenpaaren stammt und Plasmide als Klonierungsvektoren verwendet werden, muss die Bibliothek etwa rekombinierte Plasmide enthalten, die jeweils einen anderen Einschub aus 3500 bis 4500 Basenpaaren enthalten, damit ein gewünschtes Gen mit einer Wahrscheinlichkeit von 99 % in der Bibliothek vertreten ist. Die Fragmente in der genomischen Bank eines höheren Eukaryoten enthalten nicht nur Gene, sondern auch die nichtcodierende DNA, die einen grossen Teil vieler eukaryotischer Genome ausmacht. cdna-banken Eine cdna-bank ist eine Sammlung von Klonen, die für jede mrna-sequenz kodieren, die in der Zelle, aus der die mrna isoliert wurde, exprimiert werden. 8

9 Isolierung von Genen Methoden zur Isolation eines Klons Nukleinsäure-Hybridisierung Prinzip: Zwei Nukleotidstränge, welche komplementäre Basen tragen, können sich zusammenlagern und einen Doppelstrang bilden. Diese Hybride können auch dann stabil sein, wenn einzelne Nukleotide nicht zusammenpassen. Es spielt keine Rolle, ob es sich bei den Strängen um RNA oder DNA handelt. Gen-Sonden: Eine Sonde ist eine Nukleotid-Sequenz, die für eine Hybridisierung, d.h. zum Nachweis einer komplementären Sequenz in einer Nukleinsäureprobe eingesetzt wird. Es kann eine klonierte cdna zur Isolierung des Gens eingesetzt werden. Ist die Aminosäuresequenz des Proteins, das vom gesuchten Gen codiert wird, bekannt, kann man anhand des genetischen Codes die Nucleotidsequenz des dazugehörigen Gens ableiten. Das künstliche Gen, das so synthetisiert wird, ist nur teilweise komplementär zur gesuchten DNA, da eine Aminosäure oft von mehreren Codons bestimmt wird. Bsp: Die Codons für die Aminosäure Alanin sind GCA, GCT, GCG und GCC. Zwei der drei Nukleotide im Codon für Alanin können mit Sicherheit vorhergesagt werden. Ein künstlich erzeugtes Gen hat in der Regel genügend Aehnlichkeit, um als Sonde eingesetzt werden zu können: 9

10 Gehört das gesuchte Gen zu einer Genfamilie, kann ein anderes Gen aus dieser Familie als Sonde verwendet werden, da diese Gene oft genügend Sequenzidentität haben. Vorgehen: Die Klone werden auf eine Nitrozellulose- oder Nylonmembran aufgetragen und dort lysiert. Die DNA wird auf der Membran denaturiert, d.h. es entstehen DNA-Einzelstränge. Diese werden mit ihrem Zucker-Phosphat-Rückgrat fest an die Membran gebunden. Die markierten Sonden werden zugegeben. Sie hybridisieren mit den DNA-Einzelsträngen. Die Membran wird gewaschen, um die nichtgebundenen Sonden zu entfernen. Die Lage der gebundenen Sonden wird nachgewiesen. Markierung der Sonden: Einbau von radioaktiven Nukleotiden. Die Bindung der Nukleotide an die Sonde kann durch Autoradiographie nachgewiesen werden. Einbau von Nucleotiden, an welche Biotin gekoppelt wurde. Biotin hat eine hohe Affinität zum Protein Avidin. Nach dem Hybridisieren mit der biotinylierten Nukleotidsonde wird die Membran mit Avidin gewaschen. Avidin wird zuvor mit einem Fluoreszenz-Marker gekoppelt und kann so sichtbar gemacht werden. Hinweis: Sehen Sie sich den Film Prinzip der Hybridisierung in der Video-Ecke an. Immunscreening Man identifiziert mit Antikörpern das Protein, das vom gesuchten Gen codiert wird. Voraussetzung: das Gen muss von der transformierten Zelle exprimiert werden: 10

11 Hinweis: In der Lese-Ecke stehen Ihnen Lehrbücher zum vertieften Studium zur Verfügung Lösung Warum wird die bakterielle genomische DNA denaturiert und die Plasmide bleiben in Lösung? Sowohl die bakterielle genomische DNA wie auch die Plasmid-DNA sind ringförmig, unterscheiden sich aber in ihrer Grösse. Bei der Zelllyse wird die bakterielle genomische DNA aufgebrochen respektive linearisiert. Bei der Denaturierung wird die lineare DNA in Einzelstränge aufgetrennt. Die wesentlich kleinere Plasmid-DNA bleibt ringförmig und kann somit nicht denaturiert werden. Hinweis: Sehen Sie sich den Film Plasmid-DNA trennen in der Video-Ecke an. Uebungsaufgaben mit Lösungen finden Sie in der Internetversion des Ateliers! Hinweis: Das Repetitorium Molekularbiologie definiert den Stoff, welcher in den Prüfungen verlangt wird. Wegen seiner Kürze eignet es sich allerdings nicht als primäre Informationsquelle! VIREN Viren sind infektiöse Partikel, die sich in eukaryotischen Zellen vermehren. Viele von ihnen sind als Krankheitserreger bei Menschen, Tieren und Pflanzen medizinisch und ökonomisch von Bedeutung. BAKTERIOPHAGEN Bakterien können von einer Vielzahl von bakteriellen Viren, den sogenannten Bakteriophagen (kurz: Phagen) infiziert werden. Das genetische Material (Genom) dieser Phagen ist entweder doppelsträngige DNA, einzelsträngige DNA oder RNA. Das Genom ist in eine mehr oder weniger kompliziert gebaute Proteinhülle verpackt. Diese Proteinhülle dient zusätzlich der Selektion der geeigneten Wirtszellen und häufig der Injektion des Phagengenoms in die Wirtszelle. Phagen sind für ihre Vermehrung immer auf lebende Zellen angewiesen. Sie haben als 11

12 experimentelle Systeme in der Molekularbiologie und als Vektoren in der Gentechnologie grosse Bedeutung. Vermehrung Je nach Phagentyp kann die Infektion einer Wirtszelle lytisch verlaufen, oder die Wirtszelle kann lysogenisiert werden. Die lytische Infektion: Beispiel des Phagen T4: Der Phage T4 hat eine komplexe Struktur, welche im wesentlichen aus Kopf (Proteinhülle mit Doppelstrang-DNA-Genom) und Schwanz besteht: Figur: Der Phage T4 T4-Phagen erkennen Wirtszellen (E. coli) an spezifischen Oberflächenproteinen, adsorbieren an diese und injizieren die DNA ins Zellinnere. Die Phagen-DNA enthält alle Informationen, die für die Replikation des Genoms und die Produktion neuer Phagen in der Wirtszelle notwendig sind. In den ersten Minuten nach der Infektion führt die Transkription eines Teils der infizierenden Phagen-DNA durch die DNA-abhängige RNA-Polymerase der Wirtszelle zur Synthese phagenspezifischer mrnas, welche durch den Proteinsyntheseapparat der Wirtszelle in Phagen-Enzyme übersetzt werden. Kurz darauf beginnt die Replikation der Phagen-DNA mit Hilfe der neusynthetisierten phagenspezifischen DNA-Polymerase. Noch während die DNA-Synthese läuft, beginnt bereits die Synthese der Phagen-Hüllproteine und deren Zusammenbau zu Phagenköpfen. In diese wird darauf die neusynthetisierte Phagen-DNA verpackt. Zuletzt werden Phagen-köpfe und separat aufgebaute Schwanzstrukturen zu reifen Phagen verbunden. Zu den spät in der Infektion exprimierten Genen des Phagengenoms gehört auch das Gen für ein phagenspezifisches Lysozym. Dieses Enzym katalysiert den Abbau der Zellwand, was zur Lyse der Wirtszelle und zur Freisetzung der Nachkommen-Phagen führt. Der ganze lytische Infektionszyklus dauert etwa 30 Minuten. 12

13 Die lysogene Infektion: Beispiel des Phagen Lambda: Phagen, welche sowohl eine lytische als auch eine lysogene Infektion machen können, werden als temperente Phagen bezeichnet. Bei der lysogenen Infektion, die nur bei bestimmten Umweltbedingungen möglich ist, wird die infizierende Phagen-DNA ins Genom der Zelle eingebaut. Der Einbau des Lambda-Genoms erfolgt immer an der gleichen Stelle des bakteriellen Genoms, in der Nähe der Gene für Galaktoseverwertung. Es gibt aber auch Phagen, die irgendwo ins Wirtszellgenom integrieren. Im lysogenen Zustand kann das Phagengenom über viele Generationen im bakteriellen Genom integriert bleiben, und es wird als Bestandteil dieses Genoms repliziert. Vom integrierten Lambda-Genom wird jedoch nur ein einziges Gen transkribiert. Dieses Gen kodiert für ein Repressor-Protein (Lambda-Repressor), welches die Transkription der übrigen Lambda-Gene und damit die Virus-Vermehrung unterdrückt. Wenn der Lambda-Repressor inaktiviert wird (z.b. durch UV-Bestrahlung), beginnt die Transkription des eingebauten Phagengenoms. Als Folge davon wird die integrierte Lambda-DNA aus dem Wirtszellgenom herausgeschnitten, und es beginnt ein lytischer Zyklus. Figur: Lysogene Infektion Transduktion: Wenn temperente Phagen aus dem Wirtszellgenom herausgeschnitten werden, kann es vorkommen, dass ab und zu ein Wirtszell-Gen mit der Phagen-DNA herausgeschnitten und in reife Phagenköpfe verpackt wird. Nach der Freisetzung gelangen diese Gene mit der Phagen-DNA in andere Zellen und übertragen damit genetische Information ('horizontale' Verbreitung von Genen in einer Bakterienpopulation). 13

14 Restriktion und Modifikation Bakterien haben Enzyme, welche die DNA an ganz bestimmten Stellen chemisch modifizieren, meistens methylieren. Diese Enzyme und mit ihnen die Modifikationen sind von Stamm zu Stamm verschieden. Daneben verfügen die gleichen Bakterien über Desoxyribonukleasen (DNasen), welche DNA, die nicht die stammspezifischen Modifikationen aufweist, in Fragmente zerschneiden. Diese Enzyme werden als Restriktionsenzyme bezeichnet. Einige dieser Restriktionsenzyme schneiden DNA sequenz-spezifisch. Sie bilden, wie wir in der Vorlesung sehen werden, die Grundlage für die Entwicklung der ganzen Gentechnologie. Die biologische Bedeutung der Restriktions- und Modifikationsenzyme liegt darin, dass sie die Zelle vor Fremd-DNA schützen und damit die unkontrollierte Verbreitung von genetischem Material verhindern. EUKARYOTISCHE VIREN Aehnlich wie Bakteriophagen in prokaryotischen Zellen sind Viren in eukaryotischen Zellen bedeutsame Modellsysteme für molekularbiologische Studien; einige von ihnen dienen zusätzlich als Vektoren für Gentransferexperimente in eukaryotischen Systemen. Wie die Bakteriophagen sind auch Viren zur Vermehrung auf eine lebende Wirtszelle angewiesen. Strukturen In Form, Grösse, Informationsgehalt des Genoms, Wirtspezifität etc. herrscht eine ungeheure Vielfalt. Wir werden deshalb im folgenden nur einige grundlegende Eigenschaften besprechen und dabei das eine oder andere Virus als Beispiel heranziehen (siehe Tabelle). + = positive Polarität; - = negative Polarität; ss = einzelsträngig (single-stranded); ds = doppelsträngig. Viren bestehen in der Regel aus folgenden Komponenten: Figur: Schematische Darstellung einesvirus 14

15 Genom Virale Genome können aus doppelsträngiger (ds) DNA, einzelsträngiger (ss) DNA, dsrna oder RNA bestehen. Ihre Grössen variieren zwischen 10 3 (Parvovirus) bis mehr als 10 6 Nukleotide (Poxvirus). Genome können als lineare, zirkuläre oder fragmentierte Nukleinsäure-Moleküle vorliegen. Bei einzelsträngigen Nukleinsäuren kann der Strang mit positiver Polarität (gleiche Sequenz wie mrna) oder der Strang mit negativer Polarität als Genom dienen; für eine bestimmte Virus-Art ist es aber stets derselbe Strang. Virale Genome kodieren für Strukturproteine des Virus und für Enzyme, die für die Genom-Replikation benötigt werden. Capsid Eine Proteinhülle, das Capsid, umgibt das virale Genom. Das Capsid ist aus Struktureinheiten, den Capsomeren, zusammengesetzt, die in der Regel aus einer grossen Zahl eines einzigen oder ein paar wenigen Typen von Proteinen bestehen. Oft sind die Capsomere, wie in der Abbildung dargestellt, als Icosaeder angeordnet (20 gleichseitige Dreiecke). Viele Viren, unter ihnen das Poliovirus (siehe Tabelle), bestehen nur aus Genom und Capsid. Membran Sie ist, wie vorher angedeutet, nicht bei allen Viren vorhanden. Die Membran stammt von der Wirtszelle und wird vom Virus beim Austritt aus der Zelle mitgenommen (siehe unten). Sie enthält in der Regel vom Wirtsgenom kodierte und eventuell zusätzlich virus-kodierte Proteine. Beispiele von Viren mit einer Membran sind (in der Tabelle) Influenzavirus und die Retroviren. Einteilung der Viren Viren werden aufgrund ihrer Morphologie und der Grösse und Art ihres Genoms klassifiziert. Vermehrung Eintritt in die Zelle: Viren adsorbieren an spezifische Oberflächen-Moleküle der Wirtszelle. Es ist somit die Oberflächenstruktur einer Zelle, die mitentscheidet, ob eine Infektion mit einem bestimmten Virus möglich ist. Die Aufnahme eines adsorbierten Virus in die Zelle geschieht dann via Endocytose. Der Inhalt des infizierenden Virus wird darauf in der Zelle entlassen. Expression und Replikation des viralen Genoms: Die meisten Viren, die dsdna als Genom besitzen, replizieren und transkribieren die DNA im Zellkern der Wirtszelle mit Hilfe wirts-spezifischer Enzyme. Eine Ausnahme bildet das Poxvirus, das sich im Cytoplasma vermehrt und alle Enzyme für Replikation und Transkription mitbringt. Viren mit RNA-Genomen von positiver Polarität (z.b. Polioviren) können direkt mit der Proteinsynthese im Cytoplasma beginnen, da ihr Genom als mrna dienen kann. Sie replizieren ihr RNA-Genom mit Hilfe einer virus-spezifischen Replicase, welche zuerst eine RNA-Kopie mit negativer Polarität synthetisiert und diese anschliessend in RNA-Genome mit positiver Polarität kopiert. Alle diese Vorgänge finden im Cytoplasma statt. Viren mit RNA-Genomen von negativer Polarität (z.b. Influenzavirus) oder dsrna (z.b. Reovirus) benötigen eine RNA-abhängige RNA-Polymerase für Transkription und Replikation und müssen diese, da die Wirtszellen kein solches Enzym besitzen, im Viruspartikel mit in die Zelle bringen. Retroviren haben einen besonders interessanten Mechanismus der Replikation und Transkription entwickelt. Sie überschreiben ihr RNA-Genom mit positiver Polarität mittels einer viruskodierten Reversetranskriptase in dsdna. Diese dsdna-kopie des viralen Genoms wird in die Wirtszell-DNA integriert und dort wie zelleigene Gene von wirts-spezifischen Enzymen transkribiert. 15

16 Synthese der viralen Proteine Allen Viren ist gemeinsam, dass sie zur Uebersetzung ihrer mrna vollständig auf den Proteinsyntheseapparat der Wirtszelle angewiesen sind. Diese Synthese findet daher immer im Cytoplasma statt. Der darauffolgende Zusammenbau der Komponenten zum intakten Nachkommenvirus findet, je nach Virusart, im Cytoplasma oder im Zellkern statt. Freisetzung der Viren Nachkommenviren können am Ort des Zusammenbaus riesige intrazelluläre Aggregate bilden, welche nach dem Absterben und Lysieren der Wirtszelle freigesetzt werden. Gewisse Viren (z.b. Influenzavirus) synthetisieren virus-spezifische Membranproteine, welche in die Plasmamembran der Wirtszelle integrieren und später das Capsid binden. Das Nachkommenvirus tritt dann durch die Membran aus, wobei es ein Stück dieser Membran mitnimmt: Figur: Freisetzung der Viren 16