Thema Gentechnologie. Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Vorlesung #

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1 Thema Gentechnologie Erwin R. Schmidt Institut für Molekulargenetik Vorlesung #

2 Restriktionsenzyme ( Statistik:Enzymes: Total: Restriction Enzymes 3945 Type I 92 Type II 3834 Type III 11 Type IV 5 Weirdo REs 1 Putative REs 4990 Kommerziell erhältlich 641 Nucl. Acids Res. (2010) 38 (suppl 1): D234-D236. doi: /nar/gkp874

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5 Struktur R-Enzym HincII

6 Struktur der R-Endonuklease Bam HI

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8 Hochmolekulare DNA Erkennungssequenz

9 Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die DNA an palindromischen Sequenzen z. B. 5 -GGAATTCC-3

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11 Restriktionsenzyme Sternaktivität? R-Enzyme können bei suboptimalen Bedingungen eine reduzierte Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz aufweisen

12 Restriktionsenzyme Alles über R-Enzyme: tegory1.asp

13 REBASE a database for DNA restriction and modification: enzymes, genes and genomes Richard J. Roberts *, Tamas Vincze, Janos Posfai and Dana Macelis Nucleic Acids Research, 2010, Vol. 38, D

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15 Komplementäre überhängende Enden ( Sticky ends ) erleichtern das Wiederverknüpfen von DNA- Molekülen

16 Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle

17 T4-DNA-Ligase Ligase AMP Ligase E. coli DNA-Ligase AMP Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phosphodiesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen dafür Energie, die entweder durch ATP oder NAD + geliefert wird

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19 Die DNA-Ligase schleißt typischerweise nicks Oder verbindet glatte Enden miteinander

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21 In der Gentechnologie ist die Neukombination unterschiedlicher DNA- Moleküle wichtig. Das Verknüpfen von DNA- Molekülen erledigt das Enzym DNA-Ligase

22 Wie kann man die Ligationsreaktion in Richtung der bimolekularen Reaktion treiben?

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24 Asymmetrische Restriktion von Vektor und Integrat-DNA GGCC AATT AATT CCGG

25 Eine weitere Möglichkeit, nachträglich rekombinante Klone zu identifizieren, ist die Doppelselektion, dazu sind spezielle Vektoren notwendig

26 Die Voraussetzungen für Gentechnologie

27 Funktionen der Vektor DNA Sorgt für Replikation in der Wirtszelle Stellt selektierbare Markergene bereit Hat Vielzweck-Klonierungsstelle Trägt Signalsequenzen für Genexpression Verschiedenste Modifikationen für spezielle Anwendungen (z. B. Shuttle zwischen Pround Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)

28 Typen von Klonierungsvektoren - Plasmide - Phagen (M13, Lambda, P1) - Phasmide; Phagemide - Cosmide - künstl. P1_Phagenchromosomen (PAC) - künstl. Bakterienchromosomen (BAC) - künstl. Hefechromosomen (YAC) - künstl. Humanchromosomen (HAC)

29 Typische Vektoren besitzen mindestens einen Replikationsursprung (ori), selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

30 Typische Vektoren besitzen einen Replikationsursprung (Origin), selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

31 Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder Reportergene

32 Plasmide als Vektoren Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende, meist zirkuläre DNA-Moleküle, die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen

33 Plasmid-DNA E. coli DNA

34 Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform supercoiled (rechts) bzw. relaxed circle (links)

35 z.b. Resistenzplasmide aus Weaver/Hedrick

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40 Blau-weiß-Selektion mit puc-vektoren