INAUGURAL-DISSERTATION. zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin
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- Stephanie Fiedler
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1 Aus dem Institut für Veterinär-Pathologie des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin und dem Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin Physikalische Kartierung und Genomische Struktur des Kariopherin Alpha 2 Gens - Untersuchungen zu Heterozygotieverlusten in der chromosomalen Region 17q23 und zum allgemeinen Mikrosatellitenstatus an mikrodisseziierten kolorektalen und Mammakarzinomen beim Menschen INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin an der Freien Universität Berlin vorgelegt von Heiko Pidde Tierarzt aus Magdeburg Berlin 1999 Journal-Nr. 2336
2 Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Freien Universität Berlin Dekan: Univ.-Prof. Dr. K. Hartung Erster Gutachter: Univ.-Prof. Dr. R. Rudolph Zweiter Gutachter: Dr. habil. S. Scherneck Tag der Promotion:
3 meinen Kindern
4 5 INHALTSVERZEICHNIS Seite 1. EINLEITUNG 9 2. LITERATURÜBERSICHT Molekulargenetische Grundlagen Organisation des Genoms des Menschen Mikrosatellitenmarker und deren Bedeutung Intrazellulärer Proteintransport Aktiver Transport karyophiler Proteine in den Zellkern Rücktransport der Rezeptoren ins Cytoplasma Bedeutung und Aufbau des KPNA2-Gens Physikalische Kartierung Polymerasekettenreaktion (PCR) und DNA-Sequenzierung Tumorgenetische Grundlagen Kolorektales Karzinom Vorkommen und Bedeutung Mehrschrittkanzerogenese beim kolorektalen Karzinom Erblich bedingte Formen des Dickdarmkrebses Hereditäres kolorektales Karzinom ohne Polyposis (HNPCC) Reparatur-Mutator-Gene und Mikrosatelliteninstabilität Zielgene genomischer Instabilität Familiäre adenomatöse Polypose (FAP) Mammakarzinom Vorkommen und Bedeutung Brustkrebskanzerogenese Amplifikation und Überexpression von Onkogenen Heterozygotieverlust und Tumorsuppressorgene Erbliche Disposition zu Brustkrebs Tumorgenetische Untersuchungen in der Region 17q OHO31-ein Tumorsuppressorgen bei Drosophila melanogaster 26
5 6 3. MATERIAL UND METHODEN Hybridzellen Somatische Zellhybride Zellhybride mit chromosomalen Fragmenten Künstliche Hefechromosomen (YACs) Auswahl, Herkunft und Untersuchung der Hefezellen mit YACs Anzüchtung der Hefezellen DNA-Extraktion aus Hefezellen Schnellpräparation unter Verwendung von Proteinase K DNA-Präparation nach Agaroseeinbettung Bakteriophagen P1-abgeleitete künstliche Chromosomen (PACs) Auswahl, Herkunft und Untersuchung der Bakterien mit PACs Anzüchtung von Bakterien mit PACs DNA-Extraktion aus Klonen mit PACs Mini-Präparation Maxi-Präparation mittels QIAGEN Plasmid Kit Künstliche Bakterienchromosomen (BACs) Auswahl, Herkunft und Untersuchung der Bakterien mit BACs Anzüchtung von Bakterien mit BACs DNA-Extraktion aus Klonen mit BACs Untersuchungsmaterial Histologische Beurteilung und Mikrodissektion DNA-Präparation aus Zellen vom Menschen DNA-Extraktion aus Blut DNA-Extraktion aus mikrodisseziiertem Gewebe Paraffineingebettetes Gewebe Frischgewebe Polymerasekettenreaktion (PCR) Reagenzien und Bedingungen der PCR 41
6 Verwendete Primer Mikrosatellitenmarker Primer aus dem KPNA2 Gen Marker aus der Region 17q Auftrennung und Detektion der PCR-Produkte Agarosegelelektrophorese Polyakrylamidgelelektrophorese Silberfärbung Verwendung fluoreszenzmarkierter Primer DNA-Sequenzierung Sequenzierung von PCR-Produkten Direktsequenzierung von PAC-/BAC-DNA ERGEBNISSE Physikalische Kartierung eines STS-Markers aus dem KPNA2 Gen Kartierung unter Verwendung somatischer Zellhybride Kartierung mit Hilfe von YACs Zellhybride mit chromosomalen Fragmenten aus der Region 17q Konstruktion eines PAC-/BAC-Contigs Screening einer PAC-/BAC-Bibliothek mit Markern aus der Region 17q Untersuchung der PAC-/BAC-Klone mittels PCR Untersuchung von Heterozygotieverlusten in der Region 17q23 und allgemeiner Mikrosatellitenstatus Mikrodisseziierte Kolonkarzinome Mikrodisseziierte Mammakarzinome Sequenz und genomische Struktur des KPNA 2 Gens Sequenzierung genomischer DNA zur Identifizierung der Exon-Inton-Übergänge Verwendung genomischer DNA aus Leukozyten Verwendung von DNA aus dem YAC 931_d_10 und dem PAC B9_ Analyse der genomischen Struktur des KPNA2-Gens 73
7 8 5. DISKUSSION Das KPNA2-Gen und dessen Bedeutung für die Zelle Die physikalische Kartierung des KPNA2-Gens Die Konstruktion eines PAC-/BAC-Contigs und dessen Bedeutung LOH-Untersuchung in der Region 17q23 und allgemeiner Mikrosatellitenstatus Sequenz und genomische Struktur des KPNA2-Gens ZUSAMMENFASSUNG SUMMARY 85 Physical mapping and genomic structure of the Karyopherin Alpha 2 (KPNA2) Gene - Analysis of the loss of heterozygosity (LOH) in the chromosomal region 17q23 and investigation to the general state of microsatellites in microdissected colorectal and mammary carcinomas of men 8. LITERATURVERZEICHNIS ANHANG Tabelle des Zellhybridpanels Tabelle mit Patienten- und Tumordaten der Kolonkarzinome Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen 109 Danksagung Selbständigkeitserklärung Lebenslauf
8 Danksagung Mein herzlicher Dank gilt Herrn Professor Dr. R. Rudolph für die Betreuung sowie für die jederzeit gewährte Unterstützung bei der Durchführung und Abfassung der Arbeit. Bei Herrn Dr. Dr. K. Kölble möchte ich mich für die wertvollen Anregungen und Hinweise zur Bearbeitung des Themas bedanken. Bedanken möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern der Tumorgenetik des Max- Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin, die mir bei der Durchführung der Arbeit behilflich waren. Mein besonderer Dank gilt dabei Herrn O. Ullrich für eine langjährige enge Zusammenarbeit. Des Weiteren geht mein Dank an Frau B. Barthel, Frau I. Schmidt und Herrn Dr. H. Fechner für die Durchsicht des Manuskriptes. Ich bedanke mich auch bei L. Mountstephens, E. Horstkötter, Dr. M. Janz sowie bei allen nicht namentlich erwähnten Kollegen und Freunden, die zum Gelingen der Arbeit beigetragen haben.
9 Hiermit erkläre ich an Eides statt, daß ich die vorliegende Arbeit selbständig und nur unter Verwendung der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Heiko Pidde Berlin, Juli 1999
10 LEBENSLAUF Name: Heiko Pidde, geb. Schmidt Geburtsdatum: Geburtsort: Magdeburg Anschrift: Köllnische Str Berlin Familienstand: verheiratet, 2 Kinder Schulausbildung: 09/ /1985 Polytechnische Oberschule in Niederndodeleben 09/ /1987 Erweiterte Oberschule in Magdeburg Abschluß: Abitur Wehrdienst: 11/ /1989 Grundwehrdienst in der NVA Hochschulausbildung: 09/ /1995 Studium der Veterinärmedizin an der Humboldt- Universität zu Berlin, Abschluß an der Freien Universität Berlin, Abschluß: Staatsexamen Tätigkeiten: 07-10/1987 und 06-08/1989 Melker und Tierpfleger in der Landwirtschaftlichen Produktionsgenossenschaft Niederndodeleben 12/ /1998 wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Tumorgenetik am Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin 11/ /1999 Studium der Rechtswissenschaften an der Humboldt-Universität zu Berlin seit 11/1999 Aufbaustudium Gewerblicher Rechtsschutz LL.M. an der Humboldt-Universität zu Berlin
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