Die molekularbiologische Untersuchung von Morbus Wilson Durchmusterung des ATP7B Gens auf Mutationen

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1 Die molekularbiologische Untersuchung von Morbus Wilson Durchmusterung des ATP7B Gens auf Mutationen Dr. Alfred Cornelis Looman - Gene Analysis Service GmbH - Berlin Posterpresentation Morbus Wilson Symposium am in Rosenheim 1. Einleitung 1.1. Detektion des verantwortlichen Genes 1.2. Das Kupfer transportierende Protein ATP7B 1.3. Veränderungen im Gen führen (nicht immer) zu Veränderungen im Protein 1.4. Zwei Chromosomen - zwei Genkopien 2. Methodik der ATP7B Genanalyse 2.1. DNA-Isolierung aus Blut 2.2. Verfielfältigung der ATP7B Genabschnitte 2.3. Isolierung der Genabschnitte 2.4. Bestimmung der Basenabfolge der Genabschnitte (Sequenzierung) 2.5. Auswertung der Ergebnisse 3. Fazit und Ausblick Literaturreferenzen Danksagung

2 1.1. DETEKTION DES VERANTWORTLICHEN GENES Die molekulare Grundlage der Wilsonschen Krankheit sind Defekte im Kupfer transportierenden Protein P-Type-ATPase (ATP7B). Dieses Protein ist u.a. notwendig für den Transport von Kupfer aus der Leber in die Galle. Der Bauplan (Gen) für das ATP7B-Protein wurde zwischen 1985 und 1988 von verschiedenen Arbeitsgruppen auf dem Chromosom 13 des Menschen entdeckt wurde das Gen isoliert und in seiner Struktur vollständig aufgeklärt 1-3). Die Information des ATP7B-Gens liegt über etwa Buchstaben (Basen) des Erbguts verteilt und gliedert sich in 21 Abschnitte. Auf diesen Abschnitten liegt die Information für die richtige Art und Reihenfolge der Proteinbausteine, die Aminosäuren, kodiert. Sie wird im Zellkern vom Chromosom abgeschrieben und zur Boten-RNA zusammengefügt, die dann in der Zelle als Bauanleitung für das Protein verwendet wird. In Fig. 1 ist dieser, in jeder Zelle stattfindende, Informationsfluß schematisch dargestellt. ATP7B-Genort auf Chromosom 13 (~ Basen) ,11, , ' ' NH2 Transkription Splicing ATP7B-mRNA (7500 Basen) Translation ATP7B Protein (1411 Aminosäuren) Cu Cu Cu Cu Cu Cu Tm Tm Tm Tm Ph Tm Td ch ATP ATP TmTm loop hinge bp COOH Figur 1. Vom Gen zum wirksamen Protein Die Information des ATP7B-Gens befindet sich in jeder Körperzelle auf dem Chromosom Nr. 13. und umfaß ca Buchstaben (Basen) verteilt auf 21, für Proteinbausteinen kodie- renden Abschnitten und dazwischen scheinbar sinnlose Ab- schnitte, die sog. Introne. Nur in den Zellen, wo die Information gebraucht wird (z.b. Leber, Gehirn), wird die genetische Information für das ATP7B-Protein in einer Arbeitskopie abgeschrieben (Transkription). Daraus wird eine Bauanleitung (mrna) für die Proteinfabriken der Zelle (Ribosomen) gebildet, wobei die scheinbar sinnlosen Informationsabschnitte aus der Bauanleitung herausgetrennt werden (Splicing). Anhand der 7500 Buchstaben der mrna bauen die Proteinfabriken 1411 Aminosäuren in der richtigen Reihenfolge zum Kupfer transportierenden ATP7B-Protein zusammen (Translation). Das Protein unterteilt sich in verschiedene, für die Funktion wichtige, Abschnitte.

3 Tm DAS KUPFER TRANSPORTIERENDE PROTEIN ATP7B Das 1411 Aminosäuren große ATP7B-Protein enthält verschiedene Abschnitte, die für die Funktion des Proteins eine wichtige Rolle spielen. Am Beginn des Proteins befinden sich 6 Abschnitte Cu 1-6, die durch ihre spezielle Aminosäurenabfolge in der Lage sind Kupfermoleküle zu binden. Die sog. Transmembrandomänen Tm 1-7 sorgen dafür, daß das Protein fest in der Umhüllung der Zelle eingebunden wird. Weitere Abschnitte des Proteins sind für die Verlagerung der gebundenen Kupfermoleküle von der Zell-Innenseite zur Außenseite zuständig (Phosphatase, Td, Phosphorylierung, ATP-Bindung). Nur das korrekte Zusammenspiel aller Abschnitte des Proteins sorgt für eine geregelte Kupferausscheidung. Veränderungen in den funktionellen Abschnitten des ATP7B-Proteins können den Kupfertransport beeinträchtigen oder verhindern. Das ATP7B-Protein an seinem Platz in der Zellmembran ist in Fig. 2 schematisch dargestellt. Zellmembran Zell-Außenseite Cu5 Cu4 Cu6 Kupferbindung Cu3 Cu2 Zell-Innenseite Cu1 NH2 Tm2 Tm3 Tm4 Tm5 Td Tm6 Tm7 Phosphatase Phosphorylierung/ATP-Bindung COOH Fig. 2. Das Protein an seiner Wirkungsstätte Positionierung in der Zellmembran des ATP7B-Proteins 4. Die Kupfer bindenden Abschnitte Cu1-6 enthalten die Aminosäurenfolge Gly-Met-Thr-Cys-X-Ser-Cys. Der Phosphataseabschnitt enthält die Abfolge Thr-Gly-Glu-Ala. Das Transmembransegment Td enthält die Abfolge Cys-Pro-Cys Die Phosphorylierungsstelle ist durch die Abfolge Asp-Lys- Thr-Gly-Thr, die ATP-Bindungstelle durch die Abfolgen Ser-Glu-His-Pro-Leu, Thr-Gly-Asp-Asn und Gly-Asp-Gly- Val-Asn-Asp gekennzeichnet. Fehler in der Information für das ATP7B-Gen führen über eine fehlerhafte Bauanleitung letztendlich zu einem fehlerhaften Protein, das den Kupfertransport nicht mehr korrekt durchführen kann. Z.B. die häufig vorkommende His1069Gln Mutation in dem ATP-bindenden Abschnitt des Proteins.

4 1.3. VERÄNDERUNGEN IM GEN FÜHREN (NICHT IMMER) ZU VERÄNDERUNGEN IM PROTEIN Seit der Basenabfolgebestimmung des ATP7B Gens 1993, ist eine molekularbiologische Untersuchung des Morbus Wilson möglich. Durch Untersuchung von WD-Patientengruppen und Vergleichsgruppen, die nicht von der Krankheit betroffen waren, wurden mehr als 190 verschiedene Veränderungen in diesem Gen gefunden. Diese Veränderungen unterteilen sich in solche, die sowohl in der gesunden Population als auch in der Patientengruppe vorkamen (sog. Polymorphismen) und solche, die ausschließlich bei Patienten mit WD angetroffen wurden (Mutationen). Bislang wurden über 140 Mutationen gefunden die zur Beeinträchtigung oder Ausfall der Kupfer transportierenden Funktion des ATP7B-Proteins führen. Eine der häufig vorkommenden Mutationen ist eine Veränderung an der Stelle der Aminosäure 1069 im Protein. Durch die Veränderung eines Buchstaben in der Bauanleitung (A statt C) wird statt der Aminosäure Histidin, die Aminosäure Glutamin in das Protein eingebaut. Durch diese Veränderung ist eine wichtige Funktion des Proteins (die ATP-Bindung) gestört ZWEI CHROMOSOMEN-ZWEI GENKOPIEN Da vom Chromosom 13 zwei Kopien in jeder Körperzelle vorhanden sind, ist die Bauanleitung für das ATP7B-Protein auch zweifach vorhanden. Sie stammt zur Hälfte vom Chromosom des Vaters, und zur anderen Hälfte vom mütterlichen Chromosom. Nur wenn beide Chromosomen an der Stelle des ATP7B-Gens einen oder mehrere Mutationen enthalten, sind beide Bauanleitungen für das Protein defekt und verursachen das WD-Syndrom. Ist nur ein defektes Chromosom vererbt worden, tritt das WD-Syndrom nicht auf. Das defekte Chromosom kann aber weiter vererbt werden. Man spricht von Träger der Krankheit. Über den Nachweis von Mutationen im Erbgut kann festgestellt werden, ob der Patient von WD betroffen sein wird oder ob er Träger der Krankheit ist. Im nachfolgenden Abschnitt wird gezeigt, wie bei einer solchen Untersuchung vorgegangen wird.

5 2.1. DNA-ISOLIERUNG AUS BLUT Aus 0,2 ml des vom Arzt entnommenen Blutes (A) werden die DNA-haltigen weißen Blutkörperchen isoliert. Diese werden mit einer Enzymlösung bei 55 0 C aufgeschlossen (B), und die dann austretende DNA wird mit Hilfe von Zentrifugation (C) gereinigt. Die aufgereinigte DNA dient als Ausgangsmaterial für die Genanalyse. Sie enthält die Information für alle ~ Gene des Menschen, die auf 23 Chromosomen-Paare verteilt sind. Aus 0.2 ml Blut werden ca. 6 Mikrogramm DNA gewonnen. A: Ausgangsmaterial Blut B: Aufschluß der weißen Blutzellen C: Zentrifugation der isolierten DNA

6 2.2. VERVIELFÄLTIGUNG DER ATP7B GENABSCHNITTE Die Untersuchung von etwa 7500 Basen des ATP7B Gens aus den insgesamt 3 Milliarden Basen der menschlichen DNA gleicht dem Auffinden einer Nadel im Heuhaufen. Um dies zu ermöglichen, werden die Genabschnitte mit Hilfe der sog. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gezielt vervielfältigt. In einer vor Verunreinigungen geschützten Umgebung (D) werden folgende Komponenten im Reagenzröhrchen zusammengegeben: Eine kleine Menge der gereinigten DNA, DNA-Bausteine (Nukleotiden), kurze, synthetische DNA- Moleküle die dem Beginn und Ende des Genabschnittes exakt gleichen (sog. Primer) und ein Enzym (DNA- Polymerase) das in der Lage ist DNA ohne Fehler zu vervielfältigen. Dieses Reaktionsgemisch durchläuft im sog. Thermocycler (E-F) 35 Mal folgende Temperaturwechsel: 30 Sek. 95 o C, 25 Sek. 67 o C, 60 Sek. 72 o C. In jedem Schritt der Reaktion wird der zu untersuchende Abschnitt der DNA verdoppelt. Am Ende des Vorgangs liegen 2 35 oder ca Kopien vom gleichen Genabschnitt vor. Das Verhältnis von Nadel und Heuhaufen hat sich jetzt umgekehrt. D: PCR-Arbeitsplatz E: Thermocycler F: Thermocycler-Detail

7 2.3. ISOLIERUNG DER GENABSCHNITTE Die Polymerase-Kettenreaktion wird für jeden der 21 Genabschnitte des ATP7B-Gens durchgeführt. Anschließend werden die vervielfältigten DNA-Fragmente mit Hilfe der Gelelektrophorese (G-I) ihrer Größe nach getrennt, angefärbt und durch Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar gemacht (J). Jetzt können die Fragmente mit einem Skalpell aus dem Gel ausgeschnitten werden (K) und einer weiteren Reinigung unterzogen werden. G: Beladen des Geles mit Reaktionsansätzen H: Einstellen der elektrischen Spannung I: Trennung der DNA-Fragmenten im Gel J: Genabschnitten nach der elektrophoretischen Trennung K: Isolieren der Genabschnitten aus dem Gel

8 2.4. BESTIMMUNG DER BASENABFOLGE DER GENABSCHNITTE (SEQUENZIERUNG) Mit einer ähnlichen Reaktion wie der, die bei der Vervielfältigung der Genabschnitte verwendet wurde, wird jetzt jedes einzelne gereinigte Genfragment in seinem Aufbau untersucht. Bei dieser Reaktion werden die verschiedenen Bausteine der DNA (G, A, T und C) jeweils mit einer anderen Farbe gekennzeichnet. Nach Ablauf der Sequenzierungsreaktion werden die Bausteine der Fragmente im automatischen DNA-Analysegerät (L,M) getrennt und mit Hilfe von Laserlicht sichtbar gemacht. Im Computer werden die einzelnen Farbsignale in die jeweiligen Buchstaben umgesetzt (N) und das Ergebnis kann als Buchstabenfolge des Fragments abgelesen werden. L: DNA-Sequenzierungsautomaten M: Innenansicht Sequenzautomaten N: Umsetzung der Farbsignale in DNA-Buchstaben

9 2.5. AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE Die ermittelten Basenabfolgen der einzelnen Genabschnitte werden mit einer Standard-Basenabfolge für das ATP7B- Gen verglichen. Abweichungen unterteilen sich in normale Variationen (Polymorphismen) und Veränderungen mit Konsequenzen für die Funktion des Proteins (Mutationen). Veränderungen können entweder auf nur einem Chromosom vorhanden sein (heterozygot) oder beide Chromosomen (väterliches und mütterliches) können von der gleichen Mutation betroffen sein (homozygot). In den Figuren (J-L) sind einige Veränderungen im ATP7B-Gen dargestellt: J: Variation im Exon 8: Thr 762 Thr K: Variation im Exon 10: Arg 832 Lys L: Variation im Exon 13: Thr 991 Thr ACA AGG (Arg) ACG homozygot homozygot homozygot ACA und ACC AGG und AAG ACG und ACA heterozygot Arg und Lys heterozygot heterozygot M: Mutation im Exon 15: 3464delG N: Mutation im Exon 14: His 1069 Gln Normale Basenabfolge homozygot Normale Basenabfolge: CAC (His) homozygot Auf einem Chromosom fehlt der Buchstabe G an der Stelle CAC (His) und CAA (Gln) 3464 im Gen (heterozygot) heterozygot nach Aminosäure Pro 1134 ist das von einem Chromosom wird ein Literatur P Protein defekt. defektes Protein abgelesen.

10 Fazit und Ausblick Durch die Entwicklungen der letzten 15 Jahre ist es möglich geworden die molekulare Grundlage und damit die Ursache der Wilsonschen Krankheit aufzuspüren. Über die Feststellung von Veränderungen im ATP7B-Gen sind Rückschlüsse über das Ausbrechen und in Zukunft eventuell auch über den Verlauf und die optimale Therapie der Krankheit, möglich. Die Genanalyse unterstützt die klinische Diagnose in Zweifelsfällen oder wenn die Symptome der Krankheit noch nicht deutlich hervortreten. Über eine Genanalyse lassen sich Träger der Krankheit, die selber nicht betroffen sind, aber die Krankheit weiter vererben können, ausfindig machen. Insbesondere für Verwandte von Morbus Wilson Patienten kommt eine solche Untersuchung in Frage. Theoretisch ist es möglich in Leber- oder Gehirnzellen eine gesunde Kopie des ATP7B-Gens einzuschleusen und das defekte Gen zu ersetzen. Mann spricht von Gentherapie. Ein bislang noch nicht gelöstes Problem hierbei ist, daß möglichst alle Leberzellen eines Patienten dauerhaft repariert werden müssen. Versuche hierzu sind bereits angelaufen. LITERATURREFERENZEN 1 Bull, P.C. et al. (1993) The Wilson disease gene is a putative copper transporting P-type ATPase symilar to the Menkes gene. Nature Genetics 5: Tanzi, R.E. et al. (1993) The Wilson disease gene is a copper transporting ATPase with homology to the Menkes disease gene. Nature Genetics 5: Petrukhin, K. et al. (1993) Mapping, cloning and genetic characterization of the region containing the Wilson disease gene. Nature Genetics 5: DiDonato, M. and Sarkar, B. (1997) Copper transport and ist alterations in Menkes and Wilson s diseases. Biochimica Biophysica Acta 1360:3-16 DANKSAGUNG Wir danken Dr. med. E. Heyl, Dr. W. Parr und Dr. J. Ruprecht der Heyl Chem.-Pharm. Fabrik GmbH & Co. KG für die Initierung dieser Untersuchung und die fachliche Diskussion. Unser besonderer Dank gilt Dr. H.-J. Kühn, Klinik für Neurologie, Universität Leipzig für das zur Verfügungstellen einer Patientenprobe. Gene Analysis Service GmbH - Goerzallee Berlin Tel Fax looman@gene-analysis-service.de - Internet: