Dr. Peter Kainz Einführung in die Nucleinsäure-Biochemie Teil 2. III.Einführung in die Polymerase Chain Reaction (PCR)

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1 Dr. Peter Kainz Einführung in die Nucleinsäure-Biochemie Teil 2 III.Einführung in die Polymerase Chain Reaction (PCR)

2 DI Praktikumsergebnisse SS 2009 Restriktionsverdau MI V MI N

3 DI Praktikumsergebnisse SS 2009 RNA-Verdau MI V MI N

4 RT-PCR for testing the reaction components ( )

5 Roche

6 Reaktionsparameter einer Standard-PCR I. Reaktionskomponenten 1. Primer 2. dntp s 3. Puffer 4. Enzyme 5. Template 6. Ölüberschichtung II. Zyklusbedingungen

7 I. Reaktionskomponenten 1. Primer Einerseits läßt sich über die Primer am wenigsten sagen, weil sie speziell für die gewünschte Applikation maßgeschneidert werden, andererseits entscheiden sie am meisten über das Gelingen der Amplifikation! So unvorhersehbar ihr Verhalten ist, gibt es doch einige Regeln, welche die Wahrscheinlichkeit des Gelingens erhöhen: A. Länge: normalerweise Basen T m Wert: wichtig, Cyclusbedingungen müssen darauf abgestimmt werden multiplex PCR: Verwendung von mehreren Primerpaaren: T m s sind abzustimmen! Häufig Diskrepanz zwischen verschiedenen T m -Berechnungen und der Realität, d. i. Ermittlung des T m Werts eines best. DNA Fragments unter PCR-Bedingungen! ( Die anerkannteste Methode ist die nearest-neighbour Methode: basiert darauf, daß die Schmelztemperatur nicht nur von der Basenzusammensetzung, sondern auch von der Sequenz des Oligos abhängt, weil sich benachbarte Basen gegenseitig beeinflussen.) B. Sequenz: Längere C- oder G- Abschnitte vermeiden, bes. im 3 -Bereich! Komplementarität im 3 -Bereich vermeiden (Problem: Primer-Dimerisierung) Keine internen Sekundärstrukturen wie Haarnadeln (hair pins) für kritische Amplifikationen ev. HPLC-gereinigte Primer verwenden. Primer bei 4 C oder in kl. Aliquots bei 20 C lagern ( in Eppi s mit dichtem Deckel!) C. Konzentration: üblich µmol L -1.

8 T M -Wert Bestimmung eines Oligonucleotids "Hot 4" - Melting Curve 0,9 0,85 OD 260 nm 0,8 0,75 0,7 0, C

9 Sometimes nature doesn t care for our algorithms Sequence (5 to 3 ) T m (calc.) T m (measured) T m (Oligo, version 6 ) + Strand of ds DNA fragment: Tm = (G+C)% /L Tm as calculated using nearest neighbour thermodynamic values A AGCGGATAACAATATCA B TTAACCCTCACTAAAG C AGTCAGTAGTAACCAG D CACCACAAACAGAAAC E AGCGGATAACAATATCACA E-1 ACGGATAACAATATCACA E-2 CGGATAACAATATCACA F CACCACAAACAGAAACAGAAC G CGGGAATTCTGGCTCTGC therefore the proof of the pudding is in the eating!

10 C. Mülhardt, Molekularbiologie

11 Medprobe, Oligo6, primer analysis software

12 2. dntp s Die Qualität der Nucleotide kann ebenfalls einen bedeutenden Einfluß auf das Gelingen haben. Deshalb am besten in Ultrapure-Qualität kaufen Konzentration: In Standard- Protokollen ist eine Konz. von 200µmol L -1 üblich. Dies reicht für die Synthese von etwa 13µg DNA in einem 50µl Ansatz ( praktisch natürlich nie erreichbar!) Sinnvoller Konz. Bereich µM. (Fehlerhäufigkeit der Taq-Pol. fällt mit sinkender Konzentration!) als 10 oder 100mM Stammlösungen kaufen, in Aliquots einfrieren, -20 C, mind. 1Jahr haltbar.

13 3. Puffer Tris oder Tricine/Bicine: ph/ Τ bei Tris sehr hoch ( pk a von 0.021/ C ), Gefahr von Depurinierungen und dadurch Strangbrüche bei höherer Temperatur! Deshalb wird statt des ursprünglichen ph 8.3 bei RT ein Tris-Puffer von ph 9.0 verwendet. Salze: KCl (Standard: 50mM) und (NH 4 ) 2 SO 4 (20mM). NaCl hemmt die Amplifikation! Pufferzusätze: z.b.dmso, Formamid, Glycerol senken T m Werte ( ca.3 C für 10%Gl.), DMSO (maximal 10%) und Formamid (max. 5%) destabilisieren zwar einigermaßen das Enzym, deren Zusätze können aber die Spezifität und die Amplifikation von GC-reichen Sequenzen erleichtern. Glycerol dagegen macht die Polymerase hitzestabiler! Eine fixe Regel, was man wann am besten verwendet gibt es nicht, ausprobieren bleibt einem nicht erspart. Magnesium-Konzentration:optimieren! beeinflusst Primer annealing, Denaturierungsverhalten,Bildung von Primer-Dimer Artefakten, Enzymaktivität und die Genauigkeit! sinnvoll: Zur Sicherheit 0.1mm EDTA im Ansatz zum Binden von Schwermetallionen Plus one Addition ( A-Überhang am 3 -Ende, Terminale Transferase Aktivität )bei höherer Mg Konz. verstärkt. Diese ist übrigens auch abhängig von der Sequenz der letzten fünf Basen des 5 - Endes des Matrizenstranges.

14 4. Enzyme Enzymwahl: 1. Pol mit Proofreading A. (aus Archaebakterien) 2. Pol ohne Proofreading Aktivität ( aus thermophilen Eubakterien ) Archaebakterielle Pol s ( HiFi PCR ; oft verwendet wenn PCR -Produkte nachher in Expressionsvektoren kloniert werden sollen, wenn man sich lediglich für die Sequenz eines Targets interessiert,----cycle sequencing!!! Probleme mit Proofreading Polymerasen: (1)Sie bauen ssdna ab; Primer sind ssdna, d.h.als Nebenreaktion kann die Spezifität der Primer während der Reaktion verändert werden! (2) weiteres Problem: Pol kommt nach Extension ans Strangende, Enden atmen, Pol baut Nucs aus und füllt wieder auf ( dntp Verbrauch!!!) (3) Hauptproblem: Beim Denaturieren, Enden gehen auf, hyperthermophile Pol. beginnt an den Enden zu kauen ohne wieder aufzufüllen, verkürzt damit die Primeransatzstelle für das nächste Annealing! d.h. Ausbeute gering, Produkte früherer Zyklen können in späteren verschwinden! (4)weiteres Problem: Carryover-Kontamination, dutp-ung-system ist inkompatibel mit Archaebakt. Pol s! Die Verwendung archaebakt.-pol. ist vernünftig wenn man aus einem Plasmid ein kurzes Segment vermehrt bei möglichst niedriger Zyklenzahl! Sie sind aber nicht die Enzyme der Wahl, wenn mit hoher Effizienz längere Target-Sequenzen aus genomischer DNA amplifiziert werden sollen! für long range PCR : Gemisch aus 2 Polymerasen wird verwendet; (immer eine eubakterielle Pol. als Hauptanteil und etwa 1/50 bis 1/200 beträgt der Anteil an Pwo-, Pfu-oder Vent-Pol.) Extension-Temperatur nicht >68 C verwenden ( NICHT die üblichen 72 C!), zw. 65 und 68 ist die Enzym- Prozessivität am größten!

15 Enzymmenge: optimieren! frühere Angaben:2.5U/100µl, zu viel!! Richtwert: 0.5 1U/ 50µl für Taq-Pol.; für Archaebakt.Pol. deutlich mehr(~2.5u/50µl), wegen der wesentlich geringeren Prozessivität dieser Enzyme. Fehlerrate der Enzyme: liegt für Polymerasen mit Korrekturaktivität ( proofreading activity ) bei ungefähr 10-6 je eingebauter Base, für solche ohne diese Eigenschaft etwa um den Faktor 10 höher. Die Fehlerrate kann sich in Abhängigkeit von den verwendeten Bedingungen erhöhen! Temperaturabhängige Aktivität: am Bsp. Taq-Pol.: bei 70 C werden ~2800 Nucleotide/min eingebaut, bei 55 C noch 1400, bei 37 C 90 Nucleotide/min und bei 22 C immerhin noch etwa 15 Nucleotide /min. C. Mülhardt, Molekularbiologie

16 5. Template Je besser die Qualität der Template-DNA ist, desto günstiger. Das Faszinierende an der PCR ist jedoch, daß sie manchmal auch funktioniert, wenn man es ihr gar nicht zutraut ( und leider auch umgekehrt!) Templatemenge: Theoretisch reicht ein einziges Templatemolekül bereits aus, aber in der Praxis sind wenigstens 10 4 Moleküle erforderlich, um problemlos amplifizieren zu können. Zu große Mengen an Template provozieren Fehlannealing! 6. Ölüberschichtung Leichtes Mineralöl wird für klassische Geräteversionen ohne Heizdeckel verwendet, bei neuen Versionen dagegen ist der Verdunstungsschutz nicht mehr erforderlich ( 10% Volumensverringerung muß man aber in Kauf nehmen!)

17 II. Zyklusbedingungen Ein typisches PCR-Programm besteht aus Zyklen, die aus einem Denaturierungsschritt, einem Annealingschritt und einem Elongationsschritt. bestehen. Denaturiert wird bei C, dabei trennen sich die beiden Stränge der Template-DNA. Anschließend wird die Temperatur so weit gesenkt, daß es zur Hybridisierung der im massiven Überschuß vorhandenen Oligonucleotid-Primer an die einzelsträngige Target-DNA kommt (wenige Sekunden sind dafür ausreichend!) Danach wird die Temperatur auf 72 C erhöht, wobei der Primer verlängert wird, bis wieder eine doppelsträngige DNA vorliegt, die der ursprünglichen Target-DNA exakt gleicht ( Target DNA: der zu amplifizierende Teil der Template DNA). Weil die Komplementierung an beiden Strängen der Target-DNA abläuft, hat man in einem Zyklus die Zahl der Target-Moleküle verdoppelt. Wiederholt man den Zyklus, hat man schließlich die vierfache Menge usw. Eine hilfreiche Gleichung für stöchiometrische Berechnungen lautet : N = N o V n ; N o = Anfangszahl, N= Zahl nach n Zyklen, V= Vermehrungsfaktor, n= Zyklenzahl.

18 PCR Rechenbeispiele 1. 1 Unit Taq-Polymerase sind 50 fmol. Frage: Wieviele Moleküle sind 50 fmol? a. 1.5 x 10 9 b. 2 x c. 3 x Ein PCR Ansatz enthält beispielsweise als Template10 pg λ-dna: Frage: Wieviele Moleküle sind 10pg λ-dna (MW λ = 48.5 kb, MW 1bp ~ 660)? a. 1 x 10 5 b. 2 x 10 5 c. 5 x Ein PCR-Ansatz enthält u.a. 10 pg λ-dna, 1 U Taq- Polymerase, der Vermehrungsfaktor betrage 1.6. Frage: Nach welcher Zyklenanzahl entspricht die Zahl der Startstellen derjenigen der Polymerase-Moleküle im Reaktionsgemisch? X 0 = Anfangszahl X = Zahl am Ende der Reaktion (Gleichung: X = X 0 V n ) V = Vermehrungsfaktor ( theoretisch 2.0; praktisch meistens um 1.6 ) n = Zyklenzahl a. 24 b. 26 c. 28

19 PCR- Rechenbeispiele 4. Ein PCR-Ansatz enthält 10 pg λdna, 1 U Taq Polymerase, V=1.6, Ansatzvolumen =50µl; Primerkonzentration = 0.5µmol L -1 Frage: Wie hoch ist der molare Überschuß Primer zu Target-Molekülen zu Beginn der Reaktion? a. 5 x 10 6 b. 7.5 x 10 7 c. 1.2 x Ein PCR-Ansatz enthält 10 pg λ-dna, 1 U Polymerase, 0.5 µmol L -1 Primer, Reaktionsvolumen = 50µl.( Vermehrungsfaktor V sei 1.6) Frage: Nach wievielen Zyklen befinden sich gleich viele Primer-Ansatzstellen wie Primer in der Reaktion? a. nach 33 Zyklen b. nach 37 Zyklen c. nach 41 Zyklen 6. Die übliche Konzentration der dntp s in einem PCR-Ansatz (50µl) beträgt je 200µmol L -1. Frage: Wieviel DNA kann mit der vorhandenen dntp-menge theoretisch synthetisiert werden? a. ~10 µg b. ~13 µg c. ~17µg

20 Zyklenanzahl: Ab einer gewissen Produktmenge kommt es zum sog. Plateau-Effekt. Dieser ist in erster Linie auf die Adsorption der Polymerase- Moleküle an die Enden der synthetisierten Amplicons zurückzuführen ( = Endprodukt-Hemmung). Diese natürliche Bremse wird schon lange vor der Limitierung durch sinkende Primer-, dntp- bzw. gestiegene Amplicon-Konzentrationen und andere triviale Faktoren wirksam. Eine zu große Zyklenanzahl führt nie zu einer Reaktionsverbesserung! Denat.Temp. : Einerseits ist die Denaturierung ein sehr schneller Prozeß, der bereits bei Temperaturen ab 70 C beginnt. Andererseits leiden alle Komponenten unter der Hitze: die Polymerase wird denaturiert, die Nucleotide zerfallen und template-dna wie Primer werden depuriniert. Ausreichend Argumente, um die Denaturierungszeiten so kurz wie möglich zu halten. Tatsächlich reichen Zeiten von fünf Sekunden aus, um die DNA-Stränge voneinander zu trennen. Zur Orientierung: ein mit Öl überschichteter 50µl-Ansatz benötigt ca. 40 Sekunden, bis er die Temperatur des Heizblocks erreicht hat (Robocycler, Stratagene; dünnwandige Tubes). Annealing Temp.: Optimieren, nicht zu lange, wenige Sekunden genügen ( Verifizieren, daß Temp. in der Probe tatsächlich erreicht wird!) Extension-Temp.: zw. 65 C und 72 C :1-2kb/min

21 Methoden zur Vermeidung unspezifischer Amplifikationsprodukte 1. Nested PCR C. Mülhardt, Molekularbiologie

22 2. Hot Start PCR

23 3. PCR Carry-over Prevention Kit zur Vermeidung falsch positiver Amplifikationen Perkin Ellmer

24 Spontaneous deamination of cytosine Spontaneous deamination is the hydrolysis reaction of cytosine into uracil, releasing ammonia in the process. This can occur in vitro through the use of bisulfite, which converts cytosine, but not 5-methylcytosine. This property has allowed researchers to sequence methylated DNA to distinguish non-methylated cytosine (shown up as uracil) and methylated cytosine (unaltered). In DNA, this spontaneous deamination is corrected for by the removal of uracil (product of cytosine deamination and not part of DNA) by uracil glycosidase, generating an abasic (AP) site. The resulting abasic site is then recognised by enzymes, AP endonucleases) which cut the DNA and allow DNA to repair the lesion by replacement with another cytosine. Wikipedia

25 Aufgabenstellungen 1. Optimieren von Reaktionsparametern am Beispiel der Amplifikation eines 1 kb DNA Fragments aus dem Genom des Bakteriophagen λ Zusammensetzung eines Muster -PCR-Ansatzes: Wasser ad 50µl dntp-mix: je 200µmol L -1 forward-und reverse Primer 0.1 1µmol L -1 template DNA variabel Richtwerte: 10 5 Moleküle Template DNA entsprechen ca. 0.5 pg Plasmid DNA, 300 ng humaner, genomischer DNA oder der cdna von 1 µg Gesamt-RNA. 10 x Puffer 5µl Viele Puffer-Stammlösungen enthalten bereits 15 mm Mg 2+, sodass sich eine Einsatz-Konzentration von 1.5mM ergibt. Hinweis: 1.5mM Mg 2+ ist eine in vielen Fällen zu guten Resultaten führende Konzentration, vorausgesetzt die übrigen Reaktionsparameter passen dazu. Polymerase 1 Unit ( 50 fmol) Wird eine archaebakterielle Polymerase verwendet (proofreading activity!) so sollte wegen ihrer deutlich niedrigeren Prozessivität etwa 2.5U /50µl eingesetzt werden. Zu variierende Reaktionsparameter (Auswahl): a. Annealing-Temperatur, ev. Annealing-Dauer, Extension Temperatur, Polymerasekonzentration, Primerkonz., Mg-konz. b. Amplifikation eines Targets in Anwesenheit eines hohen Anteils an unspezifischer Template-DNA: Optimierung der Reaktion mittels verschiedener Hot Start Methoden)

26 2. Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR): Nachweis von β-2-mikroglobulinmrna in Gesamt-RNA aus Mäusemilz : Ausgehend von einem Aliquot der aus Mäusemilz isolierten Gesamt-RNA soll ß-2-Mikro-globulin-mRNA (ß-2-mGL) qualitativ und mittels kompetitiver RT-PCR auch quantitativ nachgewiesen werden: In einem ersten Schritt wird mittels eines genspezifischen Oligonucleotids in der Mixtur vorhandene ß-2-mGL-mRNA in cdna revers transcribiert. Nach der 30 min dauernden reversen Transcription erfolgt die Vermehrung dieser cdna mittels PCR. Im Praktikum wird ein sog. One Tube RT- PCR-Kit verwendet; dies bedeutet, dass sich sowohl Reverse Transcriptase als auch die für die nachfolgende PCR erforderlichen Reagentien gemeinsam im Ansatz befinden.

27 Abbas, Cellular & Molecular Immunology Funktion von β2-mikroglobulin

28 Grundprinzip der kompetitiven RT-PCR Man gibt dem Ansatz einen sog. Internen Standard zu, das ist eine definierte Menge einer Standard-Zielsequenz, die sich vom zu quantifizierenden Target nur geringfügig unterscheidet. Beide Sequenzen besitzen die gleichen Primeransatzstellen. So kann man davon ausgehen, dass die Amplifikationsbedingungen für beide Targets identisch sind. Man führt dann mehrere Amplifikationsreaktionen durch, bei denen jeweils gleiche vom zu quantifizierenden Target, aber unterschiedliche Mengen an Standard-Target eingesetzt werden. Die in höherer Konzentration vorliegende Sequenz wird entsprechend stärker vermehrt. Nur wenn beide Sequenzen, die exogene Standard- und die endogene Zielsequenz, in annähernd der gleichen Ausgangskonzentration vorliegen, liegen beide beim Wettstreit um die Primer gleich gut im Rennen ( Competition!) und werden deshalb gleich stark vermehrt. Dies bedeutet, dass sich in dem Ansatz, in dem beide Sequenzen gleich stark amplifiziert werden, auch die Ausgangskonzentrationen der beiden einander entsprochen haben. Da die jeweils zugegebene Standardmenge bekannt ist, kann damit auf die vorhandene Menge der endogenen Zielsequenz geschlossen werden.

29 Abb. Ergebnis einer kompetiven RT-PCR (aus einem Praktikumsprotokoll) Das Ergebnis lässt auf 10 6 endogene mrna- Moleküle im Ansatz schliessen (Beim Auftragen der Probe in der Bahn ohne Standard ging ein Großteil der Probe verloren, deshalb das geringe Fluoreszenzsignal der endogenen RNA-Bande).

30 Real Time PCR C. Mülhardt, Molekularbiologie

31 C. Mülhardt, Molekularbiologie