Inhaltsverzeichnis... I. Abbildungsverzeichnis... VI. Tabellenverzeichnis... IX. 1. Einleitung... 1

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1 ... I Abbildungsverzeichnis... VI Tabellenverzeichnis... IX 1. Einleitung Das visuelle System von Drosophila melanogaster Der morphologische Aufbau des visuellen Systems Aufbau der Ommatidien Die neuronale Superposition Die Gliaschichten der Lamina in Drosophila melanogaster... 5 Die Fensterglia... 6 Die Pseudocartridgeglia... 6 Die Satellitenglia... 7 Die Epithelialglia... 7 Die Marginalglia Die Medulla Der Neurotransmitter Histamin Signalweiterleitung über eine gestufte Umkehrsynapse Aufbau der histaminergen Synapse Postulierter Transmitterkreislauf im Auge von Drosophila Neurotransmittertransporter Die Notwendigkeit von Transportern im visuellen System Neurotransmittertransporter der solute linked carrier Familie 6 (SLC6) Der vesikuläre Monoamin Transporter dvmat Der putative Neurotransmittertransporter inebriated (ine) Aufgabenstellung und Zielsetzung Material und Methoden Material Chemikalien Kits und Verbrauchsmaterialien Verwendete Geräte und Software Enzyme und Marker I

2 Enzyme Marker Antikörper Oligonukleotide Bakterienstämme Plasmide LB Medium und Kulturplatten Drosophila Stämme Verwendete Drosophila Linien Fliegenfutter Allgemeiner Umgang mit Fliegen Methoden Molekularbiologische Arbeitsmethoden DNA assoziierte Methoden Allgemeiner Umgang mit DNA DNA Isolierung im kleinen Maßstab DNA Isolierung im mittleren Maßstab DNA Konzentrationsbestimmung Restriktionsverdau von DNA Isolierung von PCR /DNA Fragmenten nach enzymatischen Reaktionen Dephosphorylierung von DNA Ligation von DNA Fragmenten Herstellung hitzeschock kompetenter Bakterien (NovaBlue) Herstellung hitzeschock kompetenter Bakterien mit CaCl 2 Methode Transformation von kompetenten Bakterien Transformation von gespotteter DNA Bestimmung der Transformationseffizienz Anlegen von Glycerin Dauerkulturen Blau/Weiß Selektion Polymerasekettenreaktion (PCR) Durchführung einer PCR Reaktion Klonierung von PCR Fragmenten und A Tailing DNA Agarosegelelektrophorese Extraktion von DNA aus Agarosegelen II

3 Isolierung von genomischer DNA Genomische PCR RNA assoziierte Methoden Allgemeiner Umgang mit RNA RNA Isolierung aus Fliegenköpfen (TRIzol ) UV Photometrische Bestimmung der RNA Konzentration Agarose Formaldehyd Gel RACE (rapid amplification of cdna ends) cdna Herstellung RT PCR In situ Nachweis von mrna an Gewebeschnitten Herstellung des RNAi Vektorkonstruktes zur Inhibierung der Genexpression von dvmat A/B und dvmat B Proteinbiochemische Arbeitsmethoden Proteinexpression in Eschericha coli (Rosetta) Isolierung von Proteinen aus Eschericha coli Zellaufschluss mittels Microfluidizer Isolierung von Proteinen mit His 6 tag (Protino Ni TED 2000) Dialyse von Proteinlösungen Bestimmung des Proteingehaltes Semi Dry Western Blot Detektion von Proteinen an Nitrocellulosemembran Färben mittels NBT BCIP Färben mittels DAB SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS PAGE) Coomassie Färbung Zweidimensionale Gelelektrophorese (2D PAGE) Acetonfällung von Proteinen Methanolfällung von Proteinen Isolierung von Gesamtprotein aus Fliegenköpfen Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Immuncytochemischer Nachweis an Gewebeschnitten Fixierung mit Paraformaldehyd Fixierung mit EDAC und Paraformaldehyd Elektroretinogramm (ERG) III

4 2.2.6 High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Optomotorik Phototaxistest Ergebnisse Computergestützte Identifizierung putativer Histamintransporter RNA in situ Hybridisierung an Kopfpräparaten Herstellung von digoxigeninmarkierten RNA Sonden Transkriptionsmuster der Kontrollen Dopamintransporter ddat (CG8380) Serotonintransporter dsert (CG 4545) Ebony (CG3331) Transkriptionsmuster putativer Transporter ENT3 (CG11010) CG CG CG CG CG CG Orct (CG6331) Orct2 (CG13610) dvmat (CG33528) Exon8 und Rh6 (Photorezeptor 8) dvmat A (Exon 1+2 von dvmat) dvmat B (Ende des Exon9 von dvmat) Inebriated Ine (CG15444) Einsatz des GMR hid Systems zur Transporteridentifizierung Verifizierung der Verwendung des GMR hid Systems Identifizierung von putativen Transportern über RT PCR dvmat RNAi Fliegen Herstellung Herstellung der RNAi Linie doppelx Ine Antikörperherstellung Ine P2 Antikörper Ine P1 Antikörper Proteinisolierung IV

5 Zweidimensionale Gelelektrophorese Ine P2 Antikörperanalyse mittels ELISA und Western Blot Ine P1 Antikörperanalyse mittels ELISA und Western Blot Tier SAC224 (Meerschweinchen) Tier SAC Lokalisation der Transporter DVMAT B und Ine Lokalisation von DVMAT B mittels Immuncytochemie Lokalisation der Ine Proteine P1 und P Elektrophysiologische Charakterisierung von DVMAT B ERG Ableitungen Quantifizierung der ERG Transienten Phototaktisches Verhalten Wildtyp (Canton S) l(2)sh Unpräzise Jump out Linie Δ14 (homozygote) Treiberlinie repo Gal RNAi Linie doppelx induziert mit repo Gal Optomotorisches Verhalten Ine 3 Mutante Ine Rescue Fliegen Bestimmung des Kopfhistamingehaltes verschiedener ine Mutanten Diskussion Der putative vesikuläre Histamintransporter dvmat B Der Histamintransporter ine Zusammenfassung Ausblick Anhang A. Vektoren für RNA in situ Sonden Herstellung B. Abkürzungsverzeichnis Eidesstattliche Erklärung Literaturverzeichnis V