Regulation der Carotinoidbiosynthese in Nostoc PCC Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften

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Heinz Dunkle
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Regulation der Carotinoidbiosynthese in Nostoc PCC 7120 Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften vorgelegt beim Fachbereich

1 Regulation der Carotinoidbiosynthese in Nostoc PCC 7120 Dissertation Zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften vorgelegt beim Fachbereich Biowissenschaften der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main von Jürgen Mautz aus Schwabmünchen v ^ % v Frankfurt am Main, 2014 D30

2 INHALTSVERZEICHNIS I Einleitung 1 1 Carotinoide 1 2 Cyanobakterien Nostoc PCC Carotinoidbiosynthese in Nostoc PCC Die ß-Carotinketolasen CrtO und CrtW 8 3 Carotinoide in Cyanobakterien : Funktion und Regulation Schutzfunktion der Carotinoide in Cyanobakterien Lichtregulation der Carotinoidbiosynthese 11 4 Transkriptionsfaktoren in der Stoffwechselregulation in Cyanobakterien Der globale Regulator NtcA 14 5 Ziel dieser Arbeit 16 II Material und Methoden 18 1 Organismen Nostoc PCC Stämme Escherichia coli - Stämme 18 2 Anzuchten Cyanobakterien Medien und Antibiotika Anzuchtbedingungen Chlorophyllbestimmung Starklichtversuche Escherichia coli Medien und Antibiotika Anzuchtbedingungen Herstellung elektrokompetenter E. coli -Zellen 23 3 Plasmide 23 4 Oligonukleotide 24 5 Allgemeine molekularbiologische Methoden Isolation genomischer DNA aus Nostoc PCC Isolation von Plasmid - DNA aus E. coli Transformation von E. coli Reinigung von DNA Polymerasekettenreaktion (PCR) Plasmidkonstruktion Sequenzierung 29 6 Messung von relativen mrna Mengen in Nostoc PCC Isolation von RNA aus Nostoc PCC DNase-Verdau von RNA und Reverse Transkription Real-Time ppcr Auswertung 32 7 RACE PCR 33 8 Messung der Carotinoidzusammensetzung Isolation von Carotinoiden aus Nostoc PCC Isolation von Standards für die Chromatographie Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) 35 I

9 Heterologe Proteinexpression und -Reinigung 35 9.1 Heterologe Expression von Proteinen 35 9.2 Zellaufschluss 36 9.3 Reinigung über Immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie 36 9.

3 9 Heterologe Proteinexpression und -Reinigung Heterologe Expression von Proteinen Zellaufschluss Reinigung über Immobilisierter Metallionen-Affinitätschromatographie Fällung von Proteinen Denaturierende Polyacryamidgelektrophorese (SDS-PAGE) Bestimmung der Proteinkonzentration Gelretardationsstudien Charakterisierung der Ketolasen CrtW und CrtO Komplemeteriung in E. coli Expression von CrtO in Phaffia rhodozyma Expression in Rhodobacter capsulatus Überexpression und Reinigung In vitro Enzymtests B estimmung der Photosyntheserate Messung der Sauerstoffproduktion Messung der Chlorophyllfluoreszenz 41 III Ergebnisse 42 1 Carotinoide im Starklicht Identifikation der Carotinoide bei der Auftrennung mittels C i g-hplc Carotinoide in Nostoc PCC Carotinoidzusammensetzung in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation Carotinoide bei Wachstum in BG11 N - Medium Carotinoide bei Wachstumm in BG11 A - Medium Carotinoide bei Wachstum in BG Medium Carotinoidzusammensetzung in Nostoc PCC 7120AcrtO nach Normal- und Starklichtinkubation Carotinoidzusammensetzung in Nostoc PCC 7120AcrtW nach Normal- und Starklichtinkubation Carotinoidzusammensetzung in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation unter Hemmstoffeinwirkung Carotinoidzusammensetzung in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation unter H202-Einwirkung Carotinoidzusammensetzung in Nostoc PCC 7120AntcA nach Wechsel der Stickstoffquelle 56 2 Reaktion von Nostoc PCC 7120 auf Starklicht auf der Transkriptebene Etablierung und Optimierung der RealTime qpcr zur Messung von Transkriptmengen in Nostoc PCC Transkripte im Stark- und Normallicht Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto, crtw und crtp in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation in BG11 N Medium Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto, crtw und crtp in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation in BG11 A Medium Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto, crtw und crtp in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation in BG11 0 Medium Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crtw und crtp in Nostoc 7120AcrtO nach Normal- und Starklichtinkubation in BG11 N Medium 64 II

2.2.5 Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto und crtp in Nostoc PCC 7120AcrtW nach Normal- und Starklichtinkubation in BG11 N Medium 65 2.2.6 Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto, crtw und crtp in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation unter Hemmstoffeinwirkung in BG11 N Medium 67 2.

4 2.2.5 Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto und crtp in Nostoc PCC 7120AcrtW nach Normal- und Starklichtinkubation in BG11 N Medium Untersuchung der mrna - Mengen von ntca, crto, crtw und crtp in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation unter Hemmstoffeinwirkung in BG11 N Medium Transkriptmengen von ntca, crto, crtw und crtp in Nostoc PCC 7120 nach Normal- und Starklichtinkubation unter H2O2 -Einwirkung in BG11 N Medium Charakterisierung der Ketolasen CrtO und CrtW Die ß-Carotinketolase CrtO Heterologe Überexpression und funktionelle Charakertisierung von CrtO Sequenzoptimierung und Optimierung der Expression von CrtO Reinigung von heterolog exprimiertem CrtO und in vitro Funktionstest Komplementation mit CrtO Die ß-Carotinketolase CrtW Heterologe Expression Komplementation mit CrtW 78 4 Regulation durch NtcA Promotorstudien Der Promotor von crto Analyse des Promotors von crtw Der Promotor von crtpb Bindung von NtcA an die Promotorfragmente von crto, crtw und crtp Heterologe Expression und Reinigung von NtcA in E. coli Expressionsoptimierung von NtcA Reinigung von HiS6- NtcA Gelretardationsanalysen Funktionelle Überprüfung des rekombinanten NtcA NtcA - Konzentrationsabhängigkeit der Bindung Bindung von NtcA an den Promotor von crto Bindung von NtcA an den Promotor von crtw Bindung von NtcA an den Promotor von crtp Vergleich der Bindung mit verschiedener NtcA - Konzentration Abhängigkeit der Bindung von MgCh Bindung von NtcA an den Promotor von crto Bindung von NtcA an den Promotor von crtw Bindung von NtcA an den Promotor von crtp Vergleich der Bindung der Promotoren unter MgCl2 Einfluss Abhängigkeit der Bindung von 2-OG Bindung von NtcA an den Promotor von crto Bindung von NtcA an den Promotor von crtw Bindung von NtcA an den Promotor von crtp Vergleich der Bindung der Promotoren unter 2-OG Einfluss Bindung unter Einfluss von ATP Bindung von NtcA an den Promotor von crto Bindung von NtcA an den Promotor von crtw Bindung von NtcA an den Promotor von crtp Vergleich der Bindung der Promotoren unter ATP Einfluss Abhängigkeit der Bindung vom Reduktionszustand 99 5 Startpunkt der Transkription des Ketolasegens crtw Einfluss der Carotinoidzusammensetzung auf die Photosyntheseleistung in Nostoc PCC III

5 6.1 Einfluss auf die Sauerstoffentwicklung Einfluss auf die Chlorophyllfluoreszenz 103 IV Diskussion Die Ketolasen CrtO und CrtW in Carotinoidbiosyntheseweg Die Regulation der Carotinoidbiosynthese in Nostoc PCC 7120 durch Starklicht Mechanismen der Regulation Regulation durch die Stickstoffversorgung Regulation durch NtcA Regulation als Antwort auf Peroxidation durch Wasserstoffperoxid Abhängigkeit der Regulation vom photosynthetischen Elektronentransport Auswirkung der Carotinoidzusammensetzung auf die Photosynthese 121 V Zusammenfassung 123 VI Anhang Zusätzliche Daten der Carotinoidanalytik Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Literaturverzeichnis Danksagung 151 VII Lebenslauf 152 IV

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