Untersuchungen zur Biogenese von U snrnps

Transkript

1 Untersuchungen zur Biogenese von U snrnps Diplomarbeit zur Erlangung des Grades einer Diplomhumanbiologin dem Fachbereich Medizin der Philipps-Universität zu Marburg vorgelegt von Ute Schmidt aus Marburg Göttingen, im August 2001

2 Die Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit wurden am Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie (Karl-Friedrich-Bonhoeffer-Institut), Abteilung Zelluläre Biochemie, Göttingen unter der Leitung von Prof. Dr. Reinhard Lührmann zwischen September 2000 und August 2001 durchgeführt. Abgabedatum: 31. August 2001 Gutachter: Prof. Dr. Reinhard Lührmann Max-Planck-Institut für biophysikalische Chemie Abteilung Zelluläre Biochemie Am Faßberg Göttingen

3 für meine Eltern Irm und Hans

4 1. Zusammenfassungen Zusammenfassung Summary Einleitung Nukleozytoplasmatischer Transport Struktur der Kernpore Transport durch die Kernpore Substrate und Transportrezeptoren Kernimport von karyophilen Proteinen mit klassischer NLS durch den Importin α/importin β-rezeptorkomplex Der Ran-Zyklus Kerntransport von U snrnps Struktur der spleißosomalen U snrnps Biogenese der U snrnps Snurportin1-abhängiger Transport von U snrnps Aufgabenstellung und Zielsetzung Material und Methoden Material Feinchemikalien Größenstandards Radiochemikalien Enzyme und Inhibitoren verwendete Organismen Plasmide und Vektoren Antikörper Oligonukleotide Primer Käufliche Reaktionssets (Kits) Chromatographiesäulen und Säulenmaterialien Antibiotika sonstige Materialien Geräte Methoden Allgemeine Methoden Mengenbestimmung von Proteinen Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren... 24

5 Extraktion und Präzipitation von Nukleinsäuren Extraktion von Nukleinsäuren mit Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol (PCA) Ethanolfällung Butanolfällung Isopropanolfällung Gelelektrophoresen Polyacryalamid-Gelelektrophoresen Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen (SDS- PAGE) Denaturierende Gelelektrophorese von Nukleinsäuren Agarosegelelektrophorese von Nukleinsäuren Detektion von Proteinen und Nukleinsäuren Anfärben von Proteinen mit Coomassie Brilliant Blue R Silberfärbung von Proteinen in SDS Polyacrylamidgelen Autoradiographie Entwicklung radioaktiver Banden im Phosphoimager Amidoschwarzfärbung von Blotmembranen Trocknen der Gele auf Whatman-Filterpapier Trocknen der Gele zwischen zwei Cellophanfolien Ankonzentrieren von Proteinlösungen durch Zentrifugation Biochemische Methoden Chromatographische Trennmethoden Affinitätschromatographie Affinitätschromatographische Aufreinigung von GST-Fusionsproteinen Affinitätschromatographische Aufreinigung von 6xHis-markierten Proteinen (IMAC) Präparative Ausschlusschromatographie (Gelchromatographie, Gelfiltration, size eclusion) Analytische Ausschlusschromatographie zur Untersuchung von Proteinkomplexen Dialyse Proteolytischer Verdau von Proteinen Molekularbiologische Methoden Klonierung von Proteinen in Expressionsvektoren DNA Amplifizierung mittels Polymerase Chain Reaction (PCR) Aufreinigung von PCR-Produkten Spaltung von DNA durch Restriktionsendonucleasen DNA-Elution aus Agarosegelen Dephosphorylierung von überhängenden DNA-Enden... 41

6 Ligation von überhängenden DNA-Enden Sequenzierung von DNA durch Dye Deoxy Terminator-Sequenzierung Subklonierung von DNA in Vektorsysteme Plasmidpräparation Plasmidpräparation in kleinem Maßstab ( Mini-Prep ) Plasmidpräparation in großem Maßstab ( Maxi-Prep ) Zellbiologische Methoden Transformationen in Bakterienstämme Herstellung elektrokompetenter E. coli Zellen Elektroporation von E. coli Zellen Transformation in E.coli Vorbereiten einer Starterkultur Überexpression von Fusionsproteinen in E. coli Aufschliessen von E.coli Bakterienzellen Der in vitro Importassay Spezielle Methoden Radioaktive Markierungen Gekoppelte in vitro Transkription und Translation Radioaktive Endmarkierung von m 3 GpppApUpA mit [ 32 P]-pCp Elution von radioaktiv-markiertem m 3 G-cap-Oligo aus Harnstoffgelen Konzentrationsbestimmung von 3 -Endmarkiertem m 3 G-cap-Oligo im Szintillationszähler Bindungsstudien mit immobilisiertem GST-Snurportin1 Fusionsprotein ( pull down Assay ) Quervernetzungsexperimente zur Analyse von Protein-RNA-Wechselwirkungen Immunologische Methoden Western-Blot Transfer von Protein auf PVDF-Membranen Immunologische Detektion von Proteinen auf Blotmembranen Radioimmunopräzipitation Ergebnisse Etablierung einer Reinigungsmethode für rekombinantes Snurportin Überexpression von rekombinantem GST-Snurportin Isolation und Aufreinigung von GST-Snurportin Zelllysatgewinnung... 59

7 Glutathion-Affinitätschromatografie und Abspaltung von Snurportin1 mit PreScission Protease Abtrennung von Snurportin1 und freiem GST Gelfiltration Aktivitätstest des gereinigten Snurportin Charakterisierung der m 3 G-cap-bindenden Domäne von Snurportin Proteolytischer Verdau von Snurportin Identifizierung der Fragmente mittels automatisierter N-terminaler Sequenzanalyse (Edman-Abbau) UV-Quervernetzungsexperimente der Snurportin1-Fragmente zur Identifizierung der m 3 G-cap-Oligo-bindenden Domäne Klonierung von Snurportin1-Fragmenten Expression und Aufreinigung der rekombinanten Snurportin1- Deletionsmutanten Vergleich der Snurportin1/Importin β und Importin α/importin β Komplexe Proteolytischer Verdau vom Importin β in An- und Abwesenheit von Snurportin1 bzw. Importin α Vergleich des Bindungsverhaltens von Snurportin1/Importin β- und Importin α/importin β Komplexen Studien zu Interaktionen des Snurportin1/Importin β-komplexes mit dem Kernporenproteins Nup Unterschiede der Bindung von Snurportin1/Importin β- und von Importin α/importin β-komplexen an das Kernporenprotein Nup Diskussion Aufreinigung von rekombinantem Surportin Untersuchungen zur substratbindenden Domäne von Snurportin Untersuchungen zu Unterschieden von Snurportin1/Importin β und Importin α/importin β-komplexen Vergleich der Bindung von Snurportin1 und Importin α an Importin β Untersuchungen zu den Bindungsstärken von Snurportin1/Importin β- und Importin α/importin β-komplexen Interaktion des Snurportin1/Importin β-komplexes mit dem Kernporenprotein Nup Vergleich der Interaktionen von Snurportin1/Importin β- und Importin α/importin β-komplexen mit Nup153C Literaturverzeichnis...116

8 7. Anhang Abkürzungsverzeichnis Erklärung Danksagung...125