Identifizierung und Charakterisierung von SURVER, einem neuen Bindungspartner von Survivin - Funktionelle Untersuchungen zur Rolle in

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1 Identifizierung und Charakterisierung von SURVER, einem neuen Bindungspartner von Survivin - Funktionelle Untersuchungen zur Rolle in Apoptose, Zellzyklusregulation und Mitose Dem Fachbereich der Technischen Universität Darmstadt zur Erlangung des akademischen Grades eines Doktor rerum naturalium eingereichte Dissertation von Jörg von Hagen aus Diemelsee-Heringhausen Universitäts- und Larsctesbibliothak Darrnstadt Bibtiothek Biologie Tag der Einreichung 07. Mai 2004 fcw.-nr Erstberichterstatter Zweitberichterstatter Drittberichterstatter Prof. Dr. Thomas Holstein Prof. Dr. Paul Layer PD Dr. Matthias Grell Darmstadt 2004 BB TU Darmstadt Uli III

2 Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis V VIII IX 1. Einleitung Molekulare Grundlagen der Apoptose Rezeptorvermittelte Apoptose Mitochondrialvermittelte Apoptose Die Inhibitoren der Apoptose (lap's) - Inhibierung von Caspasen Die Rolle der lap's in der rezeptorvermittelten Apoptose Die Rolle der lap's in der mitochondrialvermittelten Apoptose Die Rolle der lap's in der DNA-schadenvermittelten Apoptose Survivin Survivin-bindende Proteine Survivin-bindende Proteine im Kontext von Apoptose Survivin-bindende Proteine im Kontext der Zellzyklusregulation Survivin-bindende Proteine im Kontext des "chromosomal-passengercomplex" Interaktion von SURVER mit Survivin Fragestellung Material und Methoden Material Geräte Software Verbrauchsmaterial Chemikalien / Reagenzien Enzyme : Antikörper Kits Vektoren DNA-und Protein-Größenstandards mrna und cdna für die Echtzeit-PCR im Taqman und LightCycler System Bakterien- und Hefestämme Humane Zelllinie Medien und Lösungen Methoden Molekularbiologische Methoden und DNA-Standardprozeduren Agarose-Gelelektrophorese Quantifizierung von Nukleinsäuren Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen A-Tailing am 3'OH-Ende von zu Monierender DNA TA-Klonierung in den Zielvektor RNA Isolierung von RNA aus eukaryontischen Zellen Reverse Transkription zur cdna-synthese {RT-PCR) Northern-Blot-Ana\yse ' Polymerase-Kettenreaktion- (PCR) und Echtzeit-PCR-Techniken Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Automatisierte Fluoreszenz-Sequenzierung Echtzeit-PCR-Analyse Taqman-Analyse L/gWCye/er-Analyse Relative Quantifizierung der Echtzeit-PCR 46 I

3 Zellkulturtechnik Prokaryontische Zellkultur Herstellung kompetenter Bakterienzellen Transformation von Bakterienzellen Eukaryontische Zellkulturtechnik Eukaryontische Zellkulturbedingungen Bestimmung der Zellzahl Lagerung eukaryontischer Zellen Transiente DNA-Transfektion von eukaryontischen Zellen mittels Effectene Transiente sirna-transfektion von HeLa-Zellen mittels Lipofectamine ß-Galaktosidase-Test Apoptoseinduktionsverfahren Proteinbiochemische Methoden und rekombinante SURVER-Expression Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA-TesX Baculovirusexpression von SURVER in SF 9-Zellen Proteinextraktion aus der Zellmasse der Baculovirusexpression Metallchelatchromatografie Dialyse von rekombinantem SURVER Anionenaustauschchromatografie Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese.(SDS-Page) Coomassiefärbung der SDS-Polyacrylamidgele Transfervon Proteinen durch Elektrob/otf/ngr Methoden zur Protein-Protein-Interaktionsanalyse Pftage-D/sp/ay-System Immunpräzipitation (pull-down assay) Yeast-two-hybrid-Ana\yse Protein-Lokalisationmethoden Differentielle Fraktionierung von Proteinen mit Detergenzien Mikrotubuli-Bindungstest mittels Microtubule Binding Protein Assay Kit Immunhistochemie Fluoreszenzmikroskopie Ergebnisse Untersuchungen zur Gewebeverteilung von Surver mrna-expressionsanalyse von Surver Expressionsanalyse von Surver mittels Northern-Blot Expressionsanlyse von Surver in humanen, adulten Geweben mittels Echtzeit-PCf? Expressionsanalyse von Surver in Tumorzelllinien Analyse der Proteinexpression von SURVER mittels Immunhistochemie Generierung eines SURVER spezifischen Antikörpers Mikroskopische SURVER-Expressionsanalyse in Tumorzelllinien SURVER- und Survivin-Proteinexpression in Tumorzelllinien SURVER-Expression und Lokalisation in Normal- und Tumorgeweben SURVER interagiert mit Survivin SURVER weist bioinformatorisch schwache Homologien zu beschriebenen Proteinen auf SURVER zeigt schwache Homologien zur Familie der Rho-GTPasen SURVER zeigt schwache Homologie zur SEC14P-Domäne SURVER interagiert mit weiteren Familienmitgliedern der humanen Inhibitoren der Apoptose (IAP) und apoptoseassoziierten Proteinen SURVER interagiert mit weiteren Mitgliedern der lap-familie in Retikulozytenly säten SURVER interagiert mit weiteren apoptoseassoziierten endogenen Proteinen SURVER ist kein Substrat von Caspasen Analyse der Funktion von SURVER in apoptoseinduzierten HeLa-Zellen SURVER schützt vor extrinsisch induzierter Apoptose mittels TRAIL SURVER schützt vor intrinsisch induzierter Apoptose 86 II

4 SURVER schützt vor UV-induzierter Apoptose SURVER schützt vor Camptothecin-induzierter Apoptose Effekt von Surver-siRNA und -shrna auf diverse apoptotische Stimuli Echtzeit-PCR-Analyse zur Bestimmung der Surver-mRNA-Degradation Blockierung der SURVER-Überexpression Effekt von Surver-siRNA auf TRAIL-induzierte Apoptose in HeLa-Zellen Effekt von Surver-siRNA auf UV-induzierte Apoptose in HeLa-Zellen Surver-Überexpression führt zur transkriptionellen Verstärkung der lap-expression ohne Aktivierung von NFKB oder der Phosphorylierung von CDC Surver-Expressionsrate zeigt eine Aktivierung der lap's auf mrna- Expressionsebene Surver-Expressionsrate aktiviert die lap-expression und zeigt keine Modulation von NFKB und CDC2 auf Proteinebene Identifizierung der Bindungsregion von SURVER an Survivin und XIAP Charakterisierung der SURVER-Survivin Interaktionsregion Charakterisierung der SURVER-XIAP-Interaktionsdomäne Identifizierung von SURVER-bindenden Survivin-Maus-Isoformen SURVER interagiert nicht mit der funktioneilen BIR-Domäne von Survivin Proteinexpression und Proteinaufreinigung von rekombinantem SURVER Proteinaufreinigung von rekombinantem SURVER-Histidin Fusionsprotein mittels Metallchelatchromatografie Proteinaufreinigung von rekombinantem SURVER mittels Anionenaustauschchromatografie Identifizierung von SURVER spezifisch bindenden Peptidsequenzen mittels Phage-Display (Ph.D.) System" Identifizierung von SURVER-Interaktionspartnern im hefebasierenden Protein-Ihteraktionsmodell (Yeast-two-hybridSystem) SURVER interagiert mit Lapseri im Retikulozytenlysat Charakterisierung der SURVER-Lapseri-Interaktionsdomäne Dephosphorylierung von CDC2 durch SURVER-Überexpression in Abhängigkeit der UV-induzierten Apoptose Lokalisation von endogenem SURVER Lokalisation von SURVER in fraktionierten HeLa-Zellen Detektion von SURVER in Mikrotubuli-assoziierter Proteinfraktion Interaktion von rekombinantem SURVER mit Mikrotubuli im Mikrotubuli-Bindungstest Lokalisation von endogenem SURVER mittels Fluoreszenzmikroskopie Kolokalisation von SURVER und der DNA in der Meta-, Ana- und Telophase der Mitose Kolokalisation von SURVER und Survivin in der Metaphase Kolokalisation von SURVER und Aurora B Diskussion Charakterisierung der SURVER-Interaktionen Expressionsanalyse von SURVER SURVER in der Apoptose SURVER in der Zellzyklusregulation Wirkung von SURVER auf CDC2 bzw. am G 2 /M-Kontrollpunkt SURVER im "chromosomal passenger complex" in der Mitose Zusammenfassung Literaturverzeichnis 138 III

5 8. Anhang DAB-Färbeprotokoll der humanen Gewebearrays am D/'scovery-Färbeautomat...: Zusammenstellung des Tumorzelllinien-zArray Pathologische Charakterisierung der Gewebeproben des humanen Gewebea/rays Surver-cDNA und Proteinsequenz Einzelexperimente der Apoptoseinduktion nach TRAIL-Behandlung Einzelexperimente der Apoptoseinduktion nach UV-Behandlung Einzelexperimente der Apoptoseinduktion nach Camptothecin-Behandlung Röntgenkristallstruktur des Survivin-Monomermoleküls Röntgenkristallstruktur des Survivin-Dimermoleküls Lebenslauf Eidesstattliche Erklärung 169 IV