Genexpressionsanalyse von DNA-Reparaturgenen in primären. Fibroblasten von Tumorpatienten mittels Real Time-PCR
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- Greta Hofmann
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1 Aus dem Institut für Humangenetik der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Genexpressionsanalyse von DNA-Reparaturgenen in primären Fibroblasten von Tumorpatienten mittels Real Time-PCR Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz vorgelegt von Holger Schön aus Ludwigshafen Mainz,
2 1. Einleitung Zusammenfassung 1 2. Literaturdiskussion Warum DNA-Reparatur? Signalwege Tumorentstehung und erbliche Varianten Tumorentstehung Erbliche Tumoren Genexpression und Tumor Epigenetische Regulation der Genexpression Kotranskriptionelle und posttranskriptionelle Modifikationen der mrna Material und Methoden Material Zellmaterial für die Genexpressionsanalyse mittels Real-Time PCR Verwendete Primer ATM (Ataxia telangiectasia mutated) CDKN1A (Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)) DNMT3A (DNA (cytosine-5-)-methy!transferase 3 alpha) EEF1G (Eukaryotic translation elongation factor 1 gamma) ERCC2 (Excision repair cross-complementing rodent repair deficiency, complementation group 2) FTH1 (Ferritin, heavy Polypeptide 1) KRT17 (Keratin 17) LIG4 (Ligase IV, DNA, ATP-dependent) OSGEP (O-sialoglycoprotein endopeptidase) PAK2 (p21 protein (Cdc42/Rac)-activated kinase 2) POLK (Polymerase (DNA directed) kappa) RAD9A (DNA repair exonuclease rad9 homolog A) RAD9B (DNA repair exonuclease rad9 homolog B) RFC2 (Replication factor C (Activator 1) 2) 27
3 RFC5 (Replication factorc (activator 1)5) RRN18S (18S ribosomal RNA) SH3KBP1 (SH3-domain kinase binding protein 1) SP011 (Meiotic protein covalently bound to DSB homolog (S. cerevisiae)) TBP (TATA box binding protein) TIE1 (Tyrosine kinase with immunoglobulin-like and EGF-like domains 1) TNKS2 (Tankyrase, TRF1-interacting ankyrin-related ADP-ribose Polymerase 2) UBE2V1 (Ubiquitin-conjugating enzyme E2 variant 1) VIM (Vimentin) Verwendete Chemikalien Verwendete Geräte Verwendete Software Methoden Molekularbiologische Methoden RNA-Extraktion Qualitätsbestimmung mittels Gelelektrophorese Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels Nanodrop cdna-synthese / Reverse Transkription PCR-Techniken Polymerase-Kettenreaktion (PCR) allgemein Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) Festlegung der geeigneten endogenen Kontrollgene für die Real-Time PCR DNA Reparatur nach induzierter Bestrahlung Ergebnisse Auswahl der Gene für die Expressionsanalyse mittels Real-Time PCR Messung der Expression der Gene ATM, CDKN1A, LIG4, PAK2, TIE, UBE2V1 und TBP in den Fibroblastenzellen der Kontrollindividuen Messung der Expression der Gene ATM, CDKN1A, LIG4, PAK2, und UBE2V1 in den Fibroblastenzellen der Krebspatienten (1N- und 2N-Kollektiv) Messung der Expression von elf weiteren Genen in den Fibroblastenzellen der Kontrollindividuen Messung der Expression von elf weiteren Genen in den Fibroblasten der Krebspatienten (1N- und 2N-Kollektiv) 56
4 4.6 Vergleich des Expressionsniveaus der 17 Gene zwischen dem 1N- und 2N- Koilektiv Expressionsanalyse nach Induktion der Zelllinien des des 1N- und 2N- Kollektivs mittels 1 Gy starker ionisierneder Strahlung Expressionsvergleich des Gens RAD9A zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs Expressionsvergleich des Gens CDKN1A zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs Expressionsvergleich des Gens VIM zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs Expressionsvergleich des Gens RFC2 zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs Expressionsvergleich des Gens KRT17 zwischen den behandelten und unbehandelten Proben des 1N- und 2N-Kollektivs mrna-expression von zehn Kandidatengenen in den uninduzierten Fibroblasten des 2N-Probanden KKR A24 im Vergleich zu seinem monozygoten gesunden Zwilling KKR D Diskussion Rekrutierung der Patientenkollektive Bewertung der verwendeten Chemikalien Bewertung des Zellmaterials Identifizierung geeigneter Gene für die Real Time-RT-PCR Analyse mittels Microarray-Untersuchung Festlegung der endogenen Kontfollgene Die Rolle der differenziell exprimierten Gene CDKN1A, FTH1 und RAD9A bei der Zellzyklusregulation und DNA-Reparatur CDKN1A FTH RAD9A Die Expression von RAD9A, CDKN1A, VIM, RFC2 und KRT17 nach Induktion mit ionisierender Strahlung RAD9A als aktueller Forschungsgegenstand 89
5 6. Quellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Anhang Abkürzungsverzeichnis Koautorenschaft Veröffentlichungen Lebenslauf 108
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