Aus der Klinik mit Schwerpunkt Nephrologie und internistische Intensivmedizin. der Medizinischen Fakultät Charite - Universitätsmedizin Berlin

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1 Aus der Klinik mit Schwerpunkt Nephrologie und internistische Intensivmedizin der Medizinischen Fakultät Charite - Universitätsmedizin Berlin DISSERTATION Die Aktivierung des Hypoxie-induzierbaren-Transkriptionsfaktors ist notwendig, aber nicht ausreichend für die Erythropoietin Expression in Nierenzellkarzinomen Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor medicinae (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Charite - Universitätsmedizin Berlin von Markus Gläser aus Karl-Marx-Stadt/Chemnitz 1

2 1.Gutachter: Priv.-Doz. Dr.med. M.Wiesener 2.Gutachter: Prof. Dr. med. St.Loening 3.Gutachter: Prof. Dr. med. A.Kurtz Datum der Urkundenverleihung:

3 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung Erythropoietin Historische Hintergründe Syntheseorte und Regulation von EPO Hypoxia-inducible Factor-1 (HIF-1) Struktureller Aufbau Regulation von HIF Funktion des HIF-1 Gens Folgen der HIF-1 Überexpression in Tumoren Von-Hippel-Lindau-Syndrom (VHL) Entdeckung und Charakteristika/Aufbau des VHL-Gen Folgen der VHL-Gen Inaktivierung Nierenzellkarzinom (NZK) Klinische Daten des NZK Histologische Klassifikation der NZK EPO bedingte Polyzythämie Fragestellung Material und Methoden Probengewinnung und Asservierung des humanen Nierengewebes Zellkultur Proteinnachweis im Immunoblot Proteinextraktion Proteinquantifizierung Immunoblottimg Auswertung der Signale im Immunoblotting 22 3

4 Inhaltsverzeichnis 2.4. RNA Analyse im RNase Protection Assay RNA-Extraktion Quantifizierung der RNA-Extrakte Herstellung der radioaktiven Sonden RNase Protection-Assay In situ Hybridisierung Lösungen und Antikörper Chemiekalien Geräte Ergebnisse Klinische Daten Tumorkollektiv Expression der Trankriptionsfaktoren HIF-1α und HIF-2α in 33 menschlichen Nierentumoren 3.3. Expression von Erythropoietin in menschlichen Nierentumoren Hämoglobinkonzentrationen der Patienten In situ Hybridisierung für EPO Diskussion EPO Genexpression in NZK Ursachen der EPO Expression Auswirkungen der EPO Expression Perspektiven Zusammenfassung 56 4

5 Inhaltsverzeichnis 6. Literaturverzeichnis Anhang Lebenslauf Eidesstattliche Erklärung Darstellung aller Patientendaten-Tabelle Tabellenverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Danksagung 74 5

6 7. Anhang 7.1. Lebenslauf Mein Lebenslauf wird aus Datenschutzgründen in der elektronischen Version meiner Arbeit nicht mit veröffentlicht. 66

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8 7.2. Eidesstattliche Erklärung Ich, Markus Gläser, erkläre, dass, ich die vorgelegte Dissertationsschrift mit dem Thema: Die Aktivierung des Hypoxie-induzierbaren-Transkriptionsfaktors ist notwendig, aber nicht ausreichend für die Erythropoietin Expression in Nierenzellkarzinomen, selbst verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt, ohne die (unzulässige) Hilfe Dritter verfasst und auch in Teilen keine Kopien anderer Arbeiten dargestellt habe. Chemnitz, den Markus Gläser 68

9 7.4. Tabellenverzeichnis Tabelle 1: HIF und eine Auswahl seine Zielgene Tabelle 2: Patientendaten-Charité Tabelle 3: Proteinexpression von HIF-1α/HIF-2α Tabelle 4: Quantifizierung der Proteinexpression von HIF-1α/HIF-2α in klarzelligen und nicht-klarzelligen Nierenzellkarzinomen Tabelle 5: EPO-Expression in Nierenzellkarzinomen Tabelle 6: Expression von EPO in klarzelligen und nicht-klarzelligen Nierenzellkarzinomen Tabelle 7: Hb-Wert in Bezug auf Expression von HIF-1α/HIF-2α Protein und EPO mrna Tabelle 8: Darstellung aller Patientendaten 7.5. Abbildungsverzeichnis Abbildung 1: Aufbau und Regulation von HIF-1 Abbildung 2a: Immunoblot: Expression des Proteins HIF-1α in klarzelligen Nierenzellkarzinomen Abbildung 2b: Immunoblot: Expression des Proteins HIF-2α in klarzelligen Nierenzellkarzinomen 71

10 Abbildung 3a: RNase Protection Assay: Expression von EPO mrna und CA9 bei klarzelligen Nierenzellkarzinomen Abbildung 3b: RNase Protection Assay: Expression von EPO mrna von 22 Nierenzellkarzinomen Abbildung 4: Vergleich der EPO Expression mit der Hb-Konzentration Abbildung 5: Abbildung 6: Korrelation Tumorgrösse versus Hb-Wert In situ Hybridisierung von gesunden Nierengewebe, klarzelliger EPO positiver und EPO negativer NZK 7.6. Abkürzungsverzeichnis Abb. α APS ARNT AS ATP bhlh β bzw d.h. DNA DTT EPO Hb HIF IGF Ig Abbildung Alpha Ammonium persulfate aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator Amminosäuren Adenosintriphosphat basic-helix-loop-helix Beta Beziehungsweise das heißt Desoxyribonucleid acid Dithiothreitol Erythropoietin Hämoglobin Hypoxie-induzierter-Faktor Insulin-like growth factor Immunglobulin 72

11 IL-1β kd Leu ma NLS nm NO ODD O 2 PE PMSF Pro pvhl RASS RCC RNA RPM SDS TAD TEMED TNF-α VEGF VHL V z.b. ZNS Interleukin-1β kilo Dal ton Leucin Milliamper nuclear localization signal Nanometer nitric oxide (Stickstoffmonoxid) oxygen-dependent degradation domain Sauerstoff Proteinextraktionspuffer Phenylmethyl Sulfonyl Fluorid Prolin von Hippel-Lindau Protein Renin-Angiotensin System Renal cell carcinoma Ribonucleic acid Round per minute Sodium dodecyl sulfate Transaktivierundsdomäne Tetramethylethyldiamin Tumor-Nekrose-Faktor α Vascular endothel growth factor von Hippel-Lindau Erkrankung Volt zum Beispiel Zentralnervensystem 73

12 7.7. Danksagung Herrn PD Dr. M.Wiesener und Herrn Professor Dr. K.-U. Eckardt danke ich für die freundliche Überlassung des Themas, sowie der Bereitstellung bester Arbeitsbedingungen und der intensiven Betreuung während der gesamten Arbeit. An dieser Stelle sei mein ganz besonderer Dank, Herrn PD Dr. M. Wiesener, für seine ausdauernde und außergewöhnliche Betreuung vom Anfang bis zum Ende meiner Dissertationsschrift gesagt. In vielen Situationen hat er durch seine Geduld und fachliche Kompetenz das wissenschaftliche Arbeiten und das Verfassen dieser Arbeit möglich gemacht. Zu jedem Zeitpunkt hat er sich als ein gerechter und freundlicher Lehrer erwiesen. Desweiteren gilt mein Dank den übrigen Mitgliedern der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. K.-U. Eckardt. Besonders seien hier Susanne Scholz und Ahmad Sarmadi zu nennen. Auch gilt mein besonderer Dank meinen Eltern und meiner Frau, welche mir immer mit Rat und Tat zur Seite standen und immer die nötige Kraft geschenkt haben. Durch Sie ist dies überhaupt erst möglich geworden! 74