Inhaltsverzeichnis. Zusammenfassung 1. Summary 4. 1 Einleitung Das Prostatakarzinom Entstehung und Bedeutung von Lymphknotenmetastasen 9
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- Thomas Biermann
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1 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 Summary 4 1 Einleitung Das Prostatakarzinom Entstehung und Bedeutung von Lymphknotenmetastasen Das Lymphsystem Lymphknotenmetastasierung Der prämetastatische Zustand Zusammenhang von Lymphgefäßdichte, lymphatischen und hämatogenen Metastasen Die Rolle von Tumorstammzellen bei der Metastasierung Therapeutische Ansätze zur Bekämpfung metastasierender Karzinome Onkolytische Virustherapie Das Vaccinia-Virus Vaccinia-Virus-Taxonomie Morphologie von Vaccinia-Viren Replikation von Vaccinia-Viren Rekombinantes Vaccinia-Virus GLV-1 h Ziele der Arbeit 25 2 Material Chemikalien und Enzyme Puffer und Lösungen Verwendete Kits Zelllinien und Zellkulturmedien Zellinien Zellkulturmedien Synthetische Oligonukleotide Antikörper 33
2 2.7 Rekombinantes Viruskonstrukt GLV-1 h Versuchstiere Geräte und sonstige Materalien Verwendete Software 36 3 Methoden Zellbiologische Methoden Kultivierung adhärent wachsender Eukaryontenzelllinien Bestimmung der Zellzahl mit Hilfe der Neubauer Zählkammer Einfrieren und Auftauen von Zellen Generierung von PC-3-RFP-Zellen durch Antivirale Transduktion Mausexperimentelle Methoden Implantation von PC-3- und PC-3-RFP-Zellen Injektion von GLV-1 h Narkose Visualisierung von PC-3-Tumoren und Metastasen Visualisierung mit Hilfe des Fluoreszenz-Imaging Visualisierung mit Hilfe der Magnetresonanztomographie (MRT) Entnahme von Tumoren, Metastasen und Organen Isolierung und Analyse von RNA aus Tumoren, Metastasen und Lungen RNA-Isolierung aus humanen und murinen Zellen RNA-Isolierung aus Tumor- und Lymphknotengewebe Analyse der RNA im Agarosegel DNA-Verdau und RNA-Konzentrationsbestimmung cdna-synthese * Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Analyse des PCR-Produkts im Agarosegel Isolierung und Analyse von Proteinen aus Tumoren und Metastasen Herstellung von Proteinlysaten Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford 46
3 3.4.3 Analyse von Proteinen in denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gelen (SDS-PAGE) Proteintransfer auf Nitrocellulosemembran durch Western-Blot Immundetektion mittels ECL Analyse des Virustiters in Tumoren und Metastasen Analyse von Tumoren und Metastasen auf histologischer Ebene Auswertung der Fluoreszenzintensität Auswertung der Anzahl von Gefäßstrukturen 51 4 Ergebnisse Vergrößerte Lymphknoten in PC-3-Tumor-tragenden Mäusen Zeitlicher Verlauf der Vergrößerung von Lymphknoten Nachweis humaner PC-3-Zellen in vergrößerten Lymphknoten Visualisierung von PC-3-Zellen Generierung von PC-3-RFP-Zellen Implantation von PC-3-RFP-Zellen Visualisierung unterschiedlicher Metastasierungsstadien Detektion von PC-3-RFP-Metastasen prä mortem und post mortem Migration von PC-3-RFP-Zellen zwischen Metastasen Migration von PC-3-RFP-Zellen in Lymphknoten Metastasenbildung in Abhängigkeit der Tumorlokalisation Visualisierung hämatogener Metastasen Bildgebung von PC-3-Tumor und -Metastasen in der lebenden Maus durch MRT Analyse der Migration von PC-3-RFP-Zellen 66 * 4.6 Vorhandensein von Lymphgefäßen in PC-3-Tumoren Effekt von GLV-1 h68 auf PC-3-Metastasen Kolonisierung von PC-3-Metastasen und migrierenden PC-3-Zellen durch GLV-1 h Einfluss von GLV-1 h68 auf PC-3-Lymphknotenmetastasen Der Einfluss von GLV-1 h68 auf hämatogene Metastasen 73
4 4.7.4 Untersuchung des Effekts verschiedener Injektionsarten von GLV-1 h68 auf die Kolonisierung von Lymphknotenmetastasen und Tumoren Untersuchung der Kolonisierung von PC-3-RFP-Tumoren und Lymphknotenmetastasen nach i.v. Injektion von GLV-1 h Kolonisierung verschiedener Lymphknotenmetastasen durch GLV-1h Ursache der präferentiellen Amplifikation von GLV-1 h68 in Lymphknotenmetastasen Untersuchung der Amplifikation von GLV-1 h68 in lymphatischem Gewebe GLV-lh68-lnjektion in nicht-tumor-tragende Mäuse Untersuchung des lymphatischen Gewebes in Lymphknotenmetastasen Nekrotische Zonen in Tumoren und Metastasen Untersuchung von Blutgefäßen in PC-3-Tumoren und -Metastasen Anzahl von Blutgefäßen und CD31-Konzentration in Tumoren und Lymphknotenmetastasen Analyse der CD31-Expression auf Proteinebene Anzahl und LYVE-1-Konzentration der Lymphgefäße in PC-3-Tumoren und -Metastasen 88 5 Diskussion Das Metastasenmodell der humanen Prostatakarzinomzelllinie PC Ausbreitung von PC-3-Zellen über das Lymphsystem Zusammenhang zwischen lymphatischer und hämatogener Metastasierung von PC-3-Zellen Prämetastatischer Zustand von Lymphknoten Einfluss von GLV-1 h68 auf PC-3-Metastasen Besonderheiten der Kolonisierung von Lymphknotenmetastasen durch GLV-1 h Mögliche Gründe für die präferentielle Amplifikation von GLV-1 h68 in Lymphknotenmetastasen Einfluss von GLV-1 h68 auf Blut- und Lymphgefäßdichte von PC-3-Tumoren und Lymphknotenmetastasen 99 6 Literaturverzeichnis 101
5 7 Anhang Abkürzungsverzeichnis Danksagung Eidesstaatliche Erklärung Lebenslauf Publikationen Im Rahmen dieser Arbeit entstandene Publikationen Weitere Publikationen 123
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