Untersuchung der Sensitivität von Chlamydien-Isolaten. unter Verwendung verschiedener antibakterieller Wirkstoffe

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1 Aus der Klinik für Vögel, Reptilien, Amphibien und Fische der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. E. F. Kaleta Untersuchung der Sensitivität von Chlamydien-Isolaten unter Verwendung verschiedener antibakterieller Wirkstoffe (Chlortetracyclin, Doxycyclin, Enrofloxacin, Difloxacin, Clarithromycin und Erythromycin) INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Eingereicht von KINNDLE MARTA BLANCO PENA Tierärztin aus San Jose, Costa Rica Gießen 2007

2 Inhaltsverzeichnis Abkürzungen 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht Chlamydien Klassifikation und Differenzierungsmerkmale Morphologie und Biologie Epidemiologie Pathogenese und Symptome Diagnose Isolierungsmethode und direkte Erregernachweise Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Antikörpemachweise Resistenz von Chlamydien Art der Keimresistenz Arzneimittel-Konzentrationen verschiedener Wirkstoffe bei Vögeln Minimale Hemmstoffkonzentration Chemoprophylaxe und Therapie der Chlamydiose bei Vögeln Allgemeines Tetracycline Chemie Wirkungsmechanismus Pharmakokinetik Nebenwirkungen Resistenzen Chlortetracycline Chemie

3 Wirkungsmechanismus 36 Pharmakokinetik 37 Dosierung Doxycyclin 38 Chemie 38 Wirkungsmechanismus 39 Pharmakokinetik 40 Dosierung 41 Resistenzen Quinolone 41 Chemie 42 Wirkungsmechanismus 43 Pharmakokinetik 43 Nebenwirkung 43 Resistenzen Enrofloxacin 44 Chemie 44 Wirkungsmechanismus 45 Pharmakokinetik 46 Nebenwirkung 47 Dosierung 47 Resistenz Difloxacin 48 Chemie 48 Wirkungsmechnismus 48 Pharmakokinetik 49 Nebenwirkung 49 Dosierung 49 Resistenzen Makrolide 50 Chemie 50 Wirkungsmechnismus 51 Pharmakokinetik 51 Dosierung 52

4 Nebenwirkungen 52 Resistenzen Clarithromycin 53 Chemie 53 Wirkungsmechnismus 54 Pharmakokinetik 55 Nebenwirkungen 55 Dosierung 55 Resistenzen Erythromycin 56 Chemie 56 Wirkungsmechnismus 57 Pharmakokinetik 57 Dosierung 58 Nebenwirkungen 58 Resistenzen Fragestellung der eigenen Untersuchungen 60 3 Material und Methoden Material Ort und Zeitraum der Untersuchungen Herkunft der Chlamydienisolate Direkter Erregernachweis BGM-Zellkulturen Zellkulturmedien Verbrauchsmaterialien Geräte Chemikalien Reagenzien, Lösungen und Puffer für die Gimenez-Färbung Verwendete Chemotherapeutika für die Bestimmung der minimalen 70 Hemmkonzentration (MHK) Nachweis der Chlamydien mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) 70 III

5 Verbrauchsmaterialien Geräte Chemikalien Primer Puffer Methoden Passagieren der BGM-Zellen Nachweiskulturen Aufbereitung der Chlamydien zum Aufbringen auf Nachweiskulturen Nachweis der Chlamydien Nachweis der Chlamydien aus Zellkulturen Gimenez-Färbung Nachweis der Chlamydien mittels PCR Aufreinigung von DNA DNA-Amplifikation mittels PCR Vermehrung der Chlamydien Herstellen eines Erregerpellets und der Erregerstammsuspension Herstellen der Verdünnungsreihen der zu testenden Chemothera- 81 peutika Positiv- und Negativkontrollen Versuchsanordnung Mikroskopische Zählung der Chlamydien-Einschlusskörperchen Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) Bewertung der Ergebnisse 83 4 Ergebnisse Nachweis von Chlamydien mittels Poiymerase-Kettenreaktion (PCR) 85 nach KALTENBÖCK et al. (1991, 1992, 1997) 4.2 Qualitätssicherung zur Methodendurchführung bei der Bestimmung 86 der minimalen Hemmkonzentration Negativ- und Positivkontrollen 86 IV

6 4.2.2 Quantitative Bestimmung der Chlamydien-Einschlüsse Minimale Hemmkonzentration von Chlortetracyclin gegen Chlamy- 89 dien 4.4 Minimale Hemmkonzentration von Doxycyclin gegen Chlamydien Minimale Hemmkonzentration von Enrofloxacin gegen Chlamydien Minimale Hemmkonzentration von Difloxacin gegen Chlamydien Minimale Hemmkonzentration von Clarithromycin gegen Chlamy- 97 dien 4.8 Minimale Hemmkonzentration von Erythromycin gegen Chlamydien Friedman-Test Diskussion Tetracycline: Chlortetracyclin und Doxycyclin Chinolone: Enrofloxacin und Difloxacin Makrolide: Erythromycin und Clarythromycin Friedman-Test Zusammenfassung Summary Resumen Literaturverzeichnis Danksagung 137